RKER-012, ein modifizierter ActRIIB-Fc-Ligandenfänger

www.frontiersin.org/journals/cardiovascu...438/fullAbstraktEine überaktive Activin/GDF-Signalübertragung ist einer der vielen pathogenen Faktoren, die zum fortschreitenden Gefäßumbau und zur Rechtsherzinsuffizienz bei pulmonaler arterieller Hypertonie (PAH) beitragen. Im Gegensatz dazu spielen Knochenmorphogenetische Proteine ​​(BMPs) eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gefäßhomöostase. Der klinische Erfolg von Sotatercept, einem Ligandenfänger des Activin-Rezeptors (ActR)IIA-Fc, hat den Weg für die gezielte Hemmung der Activin/GDF-Signalübertragung bei PAH geebnet. Sotatercept weist jedoch Einschränkungen auf, darunter schwere Thrombozytopenie und Erythrozytose, die das Risiko eines Hyperviskositätssyndroms (HVS) und von Blutungen erhöhen können. Wir haben hier gezeigt, dass ein modifizierter ActRIIB-Fc-Ligandenfänger, KER-012/RKER-012, BMP-schonende Eigenschaften aufweist und gleichzeitig die Bindung an Activin/GDF-Liganden beibehält, ähnlich den Wildtyp-Ligandenfängern ActRIIA und ActRIIB. Wir konnten außerdem zeigen, dass Hypoxie die Anfälligkeit für HVS-bedingte Blutungen und Mortalität als Reaktion auf Erythropoietin (EPO)-induzierte Erythrozytose und schwere Thrombozytopenie bei Sugen-Ratten erhöht. Im Gegensatz zu Sotatercept löste KER-012/RKER-012 weder Erythrozytose noch Thrombozytopenie aus; daher könnte ein modifizierter ActRIIB-Fc-Ligandenfänger wie KER-012/RKER-012 das Risiko potenzieller HVS-Effekte und Blutungen verringern. Wir konnten zudem zeigen, dass RKER-012 experimentelle PAH abschwächen kann, indem es mehrere Komponenten einer komplexen Pathobiologie beeinflusst, darunter gestörtes Zellwachstum, endothelial-mesenchymale Transition (EndoMT), Umbau der extrazellulären Matrix (ECM), Entzündung, Modulation von Immunzellen und Fibrose. Diese Ergebnisse unterstreichen das Potenzial, einen Activin-Rezeptor-Ligandenfänger zu optimieren, um die überaktive Activin/GDF-Signalübertragung bei PAH gezielt zu hemmen und gleichzeitig die BMP-Signalübertragung zu schonen sowie das Risiko von Blutungen, Gefäßintegrität und Erythrozytose zu minimieren. Letztendlich könnte dieser Ansatz den Umbau der Lungengefäße verbessern und so PAH lindern.EinführungDie pulmonale arterielle Hypertonie (PAH) ist eine schwerwiegende Erkrankung, die durch erhöhten pulmonalen Arteriendruck und eine Funktionsstörung bis hin zum Versagen des rechten Ventrikels (RV) gekennzeichnet ist. Das primäre pathologische Merkmal, das die Krankheitsprogression antreibt, ist das pulmonale Gefäßremodeling, welches den Gefäßwiderstand und die Nachlast des RV erhöht. Zu den Schlüsselfaktoren, die zur Erkrankung beitragen, gehören eine gestörte Zellproliferation und Apoptose, die Aktivierung der endothelial-mesenchymalen Transition (EndoMT), das Remodeling der extrazellulären Matrix (ECM), Entzündungen, die Modulation von Immunzellen und Fibrose. Diese Mechanismen führen gemeinsam zu dem schädlichen Gewebsremodeling, das bei pulmonaler Vaskulopathie und Kardiomyopathie beobachtet wird.1–6).Ein Ungleichgewicht der TGF-β/Activin/GDF-vermittelten SMAD2/3- und der BMP-induzierten SMAD1/5/9-Signalwege wird mit pathogenen Gewebeumbauprozessen, einschließlich pulmonaler Vaskulopathie und Kardiomyopathie, in Verbindung gebracht. Eine überaktive SMAD2/3-Signalgebung ist einer der vielen pathogenen Faktoren bei PAH und anderen kardiovaskulären Anomalien, einschließlich Herzinsuffizienz. Eine unzureichende Signalgebung über SMAD1/5/9 kann hingegen durch Mutationen im BMP-Rezeptor Typ 2 (BMPR2), reduzierte BMPR2-Proteinspiegel, eine verminderte Verfügbarkeit von BMP-Liganden oder verringerte Spiegel anderer mit SMAD1/5/9 und SMAD4 assoziierter Signalmoleküle verursacht werden. Dieser Mangel führt zu einem Ungleichgewicht, das eine überaktive Signalgebung über SMAD2/3 fördert und somit zu pathologischen Ereignissen führt, die PAH zur Folge haben. Funktionsverlustmutationen im BMPR2 finden sich in über 70 % der Fälle von erblicher PAH.7,8Darüber hinaus ist die humane und experimentelle PAH in Abwesenheit dieser Mutationen mit einer verminderten BMPR2-Expression und -Signalgebung assoziiert. Die Intervention mit Sotatercept, einem ActRIIA-Fc-Ligandenfänger, zeigte, dass das Gleichgewicht der SMAD2/3- und SMAD1/5/9-Signalgebung durch das Abfangen erhöhter Activin/GDF-Liganden wiederhergestellt und kardiopulmonale Pathologien in präklinischen und klinischen Studien behoben werden können.9–13In ähnlicher Weise konnte in Tiermodellen der Herzinsuffizienz gezeigt werden, dass die gezielte Hemmung der überaktiven SMAD2/3-Signalübertragung mit anderen Inhibitoren des Activin-Rezeptor-Signalwegs, wie z. B. ActRIIB-Fc, ActRIIB/Alk4-Fc und einem Antikörper gegen ActRIIA/ActRIIB, kardioprotektiv wirkt (13–15).Der klinische Erfolg von Sotatercept bei PAH hat die Grundlage für die gezielte Beeinflussung der Activin/GDF-Signalübertragung geschaffen und den Standardtherapieansatz bei PAH und potenziell auch bei PH im Zusammenhang mit Linksherzerkrankungen revolutioniert. Sotatercept weist jedoch Einschränkungen auf, darunter schwere Thrombozytopenie und Erythrozytose, die im schweren Fall das Risiko eines Hyperviskositätssyndroms (HVS) und von Blutungen erhöhen können.16BMPs sind wichtig für die Aufrechterhaltung der vaskulären Homöostase (17Es ist bekannt, dass Ligandenfallen mit höherer Affinität zu BMPs die Gefäßintegrität stören, einschließlich Epistaxis, arteriovenöser Malformationen (AVMs) und hereditärer hämorrhagischer Teleangiektasie (HHT)-ähnlicher Phänomene (18–20Sotatercept bindet neben Activinen und GDFs auch an BMPs (21Daher stellten wir die Hypothese auf, dass ein modifizierter Activin/GDF-Ligandenfänger diese potenziellen Einschränkungen überwinden und die experimentelle PAH-Pathologie abschwächen könnte. Um diese Hypothese zu testen, entwickelten wir einen Activin/GDF-Ligandenfänger, der die pulmonale Vaskulopathie durch Reduktion der überaktiven SMAD2/3-Signalgebung bei gleichzeitiger Schonung der BMP-Signalgebung verbessert, ohne Erythrozytose oder schwere Thrombozytopenie auszulösen. In dieser Studie beschreiben wir einen neuartigen, modifizierten ActRIIB-Fc-Ligandenfänger (KER-012) und sein murines Analogon RKER-012, die das Potenzial besitzen, die kardiovaskuläre Gesundheit bei PAH zu verbessern, indem sie gezielt Liganden angreifen, die zu deren Pathophysiologie beitragen, und gleichzeitig potenzielle Beeinträchtigungen der positiven Effekte der BMP-Signalgebung minimieren. Mithilfe von Protein-Engineering entwickelten wir einen modifizierten ActRIIB-Fc-Ligandenfänger, der die BMP-Bindung minimiert – ein entscheidender Faktor für die Aufrechterhaltung der Gefäßintegrität –, während die Bindung an Activin/GDF-Liganden, ähnlich den Wildtyp-ActRIIA- und ActRIIB-Ligandenfängern, erhalten bleibt. Des Weiteren untersuchten wir die BMP-schonenden Eigenschaften von RKER-012 und verglichen es mit RAP-011 (einem murinen Analogon von Sotatercept, ActRIIA-Fc) hinsichtlich der Hemmung des BMP/ALK1-abhängigen Gefäßwachstums im neonatalen Mausmodell. Wir erforschten die Wirkung von KER-012/RKER-012 auf die Erythrozytose bei Javaneraffen und in einem Sugen-Hypoxie-(SuHx)-Rattenmodell der pulmonalen arteriellen Hypertonie (PAH). Gleichzeitig untersuchten wir die therapeutischen Effekte von RKER-012 auf die pulmonale Vaskulopathie, die rechtsventrikuläre Dysfunktion und das Remodeling in einem SuHx-Rattenmodell der PAH. Zusätzlich untersuchten wir einen direkten kardioprotektiven Effekt auf den rechten Ventrikel (RV) in einem durch Pulmonalarterienbanding (PAB) induzierten RV-Versagensmodell. KER-012 wurde außerdem in einer klinischen Phase-I-Studie an gesunden postmenopausalen Frauen untersucht. Obwohl diese Population klinisch gesund ist, besteht ein erhöhtes Risiko für subklinische Erkrankungen, einschließlich Herzerkrankungen. Dies könnte potenziell Aufschluss über den Wirkmechanismus und den biologischen Nachweis von KER-012 bei Krankheitsprozessen geben. In dieser Studie wurde eine explorative Serumproteomik-Analyse durchgeführt, um Biomarker der KER-012-Aktivität und proteomische Veränderungen zu identifizieren, die mit der Übertragbarkeit pharmakologischer Eigenschaften von Nagetiermodellen auf den Menschen übereinstimmen.MethodenRationales Proteindesign und In-vitro -Charakterisierung von KER-012KER-012 ist ein homodimeres Fc-Fusionsprotein, das aus einer modifizierten extrazellulären Domäne (ECD) des Activin-Rezeptors Typ IIB (ActRIIB) besteht, die über ein kurzes Linkerpeptid mit einer humanen Immunglobulin-G1-Fc-Domäne (IgG1) fusioniert ist, einschließlich der Scharnierregion, der CH2- und der CH3-Domäne. Die Modifikation der ECD erfolgte durch rationales Proteindesign, das die Deletion/Substitution spezifischer Aminosäurereste beinhaltete.22Dieser Ansatz wurde in die extrazelluläre Domäne (ECD) des Wildtyp-ActRIIB implementiert, um eine höhere positive Ladung an der Rezeptor-Ligand-Grenzfläche einzuführen und so die BMP9-Bindung zu reduzieren. RKER-012 ist ein Forschungsanalogon von KER-012 und besitzt anstelle der humanen IgG1-Fc-Domäne von KER-012 eine murine IgG2a-Fc-Domäne. KER-012 und RKER-012 weisen dieselbe ECD auf, die für die Ligandenbindung verantwortlich ist. Die Ligandenbindungsaffinitäten wurden für eine Reihe von TGF-β-Liganden mittels Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) im Vergleich zu einer Kontroll-ECD des Wildtyp-ActRIIB bestimmt. Zusätzlich wurde die Liganden-abhängige Signalhemmung in einem zellulären Assay (halbmaximale Hemmkonzentration, IC₅₀) evaluiert, um die Wirksamkeit jeder Variante gegenüber derselben Ligandenreihe zu bestimmen.Expression und Reinigung rekombinanter ProteineDie modifizierte extrazelluläre Domäne von ActRIIB wurde synthetisiert, mittels PCR amplifiziert und in einen Säugetier-Expressionsvektor kloniert. KER-012 wird rekombinant in CHO-Zellen (Chinese Hamster Ovary) hergestellt. Der Überstand aus dem konditionierten Medium wird gesammelt und durch nachfolgende Aufreinigungsschritte, darunter Säulenchromatographie, Proteinkonzentration und Tangentialflussfiltration, gereinigt. Die Produktionszellkultur wird mit einem vorsterilisierten Einwegfilter geerntet, und der Überstand wird anschließend mittels Affinitätschromatographie mit MabSelectSure Protein A-Harz (Cytiva) und Glycin-Elution gereinigt. Fraktionen mit reinem, rekombinantem Protein werden charakterisiert, vereinigt, konzentriert und mittels TFF-System (Formulatrix) gegen 1xTBS ausgetauscht.OberflächenplasmonenresonanzDie Bindungskinetik von ActRIIB-Varianten an ausgewählte Liganden wurde mittels Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) mit einem Biacore T200-System (GE Healthcare, Cytiva) bestimmt. Kurz gesagt, der Anti-Human-IgG-Antikörper wurde in Natriumacetat (pH 5,0) verdünnt und mittels Aminokupplung auf einem CM4-Sensorchip (Cytiva, Kat.-Nr. 29104989) immobilisiert. Die Durchflusszellen 2–4 dienten der Bindungsanalyse, während Durchflusszelle 1 zur Messung der unspezifischen Bindung an die Chipoberfläche verwendet wurde. Liganden-Fc wurde bis zu einer Konzentration von ca. 200 RU auf dem Sensorchip gebunden. Die Liganden wurden in HBS-EP+-Laufpuffer in Konzentrationen von 0 nM bis 100 nM verdünnt, abhängig vom jeweiligen Liganden. Anschließend wurde ein Ligand mit einer Flussrate von 40 μL/min über 60 s durch alle Durchflusszellen injiziert, um die Assoziationsrate des Liganden zu messen. Danach floss der Laufpuffer weitere 160–180 s durch die Durchflusszellen, um die Dissoziationsrate zu bestimmen. Jegliche Bindung, die im Referenzfluss beobachtet wurde, wurde von den Werten der Durchflusszellen mit KER-012 subtrahiert. Die Oberfläche wurde zwischen den einzelnen Zyklen gemäß den Herstellerangaben regeneriert, um gebundenes Protein zu entfernen. Die kinetische Anpassung wurde mit der Biacore Insight Evaluation Software ausgewertet. Die Werte für K_on (Assoziationsrate) und K _off (Dissoziationsrate) wurden zur Berechnung von K_D = K_off /K_on verwendet .Zellbasierte AssaysKurz gesagt, wurden Assays mit HEK-293-SBE-Luciferase-Reporterzellen (BPS Bioscience, Kat.-Nr. 60653) durchgeführt, um die durch jeden Activin- und Wachstumsdifferenzierungsfaktor-Typ-Liganden vermittelte SMAD2/3-Phosphorylierung zu messen, sowie mit C2C12-BRE-Luciferase-Reporterzellen (23Um die durch Knochenmorphogenetisches Protein (BMP)-Liganden vermittelte SMAD1/5/9-Phosphorylierung zu messen, wurden die Zellen in einer 96-Well-Platte (3 × 10⁶) ausgesät.4Zellen/Well) und über Nacht anhaften gelassen. Am nächsten Tag wurde jede Ligandenfalle in einer 96-Well-Platte in DMEM (Gibco, Kat.-Nr. 10567-014) mit 0,1 % FBS (Gibco, Kat.-Nr. 16140-071) titriert und der ausgewählte Ligand in der gewünschten Konzentration zu jedem Well gegeben. Nach Verdünnung von KER-012 und dem Liganden wurde die Verdünnungsplatte versiegelt und 1 h bei 37 °C inkubiert. Nach einer Stunde Inkubation wurde die Titrationsplatte aus dem Inkubator entnommen. Das Medium der Zellen wurde vorsichtig abgesaugt und durch 100 µL der vorinkubierten KER-012/Ligand-Mischung ersetzt. Die Wells der Positivkontrolle erhielten nur den Liganden, die Wells der Negativkontrolle nur Medium ohne Nährstoffe. Nach weiteren 21 Stunden im Inkubator wurden die Platten mit dem Promega Steady-Glo® Luciferase Assay System gemäß dem Protokoll auf einem PerkinElmer EnSight Multimode-Plattenlesegerät analysiert. Nach Subtraktion des Mittelwerts der Negativkontrollen wurde die Hemmung als prozentualer Signalverlust im Vergleich zu den gemittelten Positivkontrollen berechnet. Die Daten wurden in GraphPad Prism dargestellt und die IC ₅₀-Werte mittels nichtlinearer 4-Parameter-Regression berechnet. Die Vorinkubation der Zellen mit einer geeigneten Titration von KER-012 ermöglichte die Quantifizierung (über den IC₅₀-Wert) der inhibitorischen Aktivität gegen die Liganden-vermittelte SMAD-Signalübertragung für jeden Liganden.TierstudienAlle Tierversuche wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tierversuche (Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC) genehmigt und gemäß den Richtlinien für die Haltung und Verwendung von Labortieren der US-amerikanischen National Institutes of Health (NIH) durchgeführt. Die Studien mit nicht-humanen Primaten (NHP) wurden bei Charles River durchgeführt. Die Studie wurde von der dortigen Ethikkommission geprüft und genehmigt. Die Einrichtung ist von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, International (AAALAC) akkreditiert und beim US-Landwirtschaftsministerium (USDA) registriert.Hämatologische Beurteilung bei nicht-menschlichen PrimatenKurz gesagt, wurde das Sysmex XN-100 V zur Messung der Erythrozytenzahl verwendet. Die hämatologische Untersuchung erfolgte an 1 ml Vollblut, das über die Femoralarterie von 2- bis 4-jährigen Javaneraffen ( n  = 6/Geschlecht/Gruppe) entnommen wurde, denen KER-012 alle zwei Wochen subkutan in Dosen von 0 (Vehikel), 3, 10 oder 50 mg/kg über 190 Tage verabreicht wurde.NeovaskularisationsstudieIn dieser Studie wurden Jungtiere von C57BL/6-Mäusen (Inotiv, Indianapolis, IN, USA) zur Untersuchung der retinalen Neovaskularisation verwendet. Die Jungtiere wurden am ersten (P1) und dritten (P3) postnatalen Tag subkutan mit Vehikel, ALK1-hFc (10 mg/kg), RAP-011 (10 mg/kg), RAP-011 (20 mg/kg), RKER-012 (10 mg/kg) oder RKER-012 (20 mg/kg) behandelt. Am achten (P8) der Studie wurden die Jungtiere gemäß den AVMA-Richtlinien durch Hypothermie und anschließende Dekapitation euthanasiert. Die Retinae wurden entnommen, in Formalin fixiert und mit AlexaFluor® GS-IB4-Isolectin (Thermo Fisher, Kat.-Nr. I21411) gefärbt. Die präparierten Retinae wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert.Studie zur durch Erythrozytose vermittelten HyperviskositätEin Sugen-Hypoxie-Rattenmodell wurde verwendet, um das durch Erythrozytose vermittelte Hyperviskositätssyndrom und dessen Einfluss auf Blutungen zu untersuchen. Männliche Sprague-Dawley-Ratten (ca. 250 g, Innotiv, Indianapolis, IN, USA) erhielten über 5 Wochen eine Einzeldosis SU5416 (Sugen, Cayman Chemical, Kat.-Nr. 13342) (Su, 20 mg/kg s.c.) und Epoetin-alpha (Amgen, Kat.-Nr. 10038921) (EPO, 7200 U/kg s.c.) oder Vehikel unter normoxischen (SuNx-EPO) oder normobaren hypoxischen (SuHx-EPO, 10 % O₂) Bedingungen (OxyCycler A84XO, Biospherix, Parish, NY, USA) und wurden mit normoxischen (Nx) Kontrollen verglichen. Blutbild, Viskosität, Blutungsereignisse und Überleben wurden analysiert.Sugen-Hypoxie-Ratten-PAH-StudieIn dieser Studie wurden männliche Sprague-Dawley-Ratten (241–295 g; Charles River) für das Sugen-Hypoxie-Modell der pulmonalen arteriellen Hypertonie (PAH) verwendet. Zu Beginn der Studie wurde den Ratten subkutan entweder 200 mg/kg SU5416 (Sugen; Tocris Biosciences; Medkoo Biosciences), suspendiert in 100 % Dimethylsulfoxid (DMSO; JT Baker, Allentown, PA, USA), oder das Vehikel (DMSO) verabreicht. Die Ratten wurden entweder normoxischen (Nx; ∼21 % O₂) oder normobaren hypoxischen (Hx; ∼13 % O₂) Bedingungen ausgesetzt (Hypoxico, New York, NY, USA). Nx-Ratten ( n  = 6) wurden mit Vehikel behandelt, während Hx-Ratten ( n  = 11–12) zweimal wöchentlich über 3 Wochen entweder 10 mg/kg RKER-012 oder das Vehikel (TBS) subkutan erhielten. Die Verabreichung eines ähnlichen Activin-Rezeptor-Ligandenfängers in einer Dosis von 10 mg/kg zweimal wöchentlich hat sich zuvor als wirksam erwiesen, um den Activin-Signalweg zu blockieren und eine optimale therapeutische Wirksamkeit in experimentellen Modellen der pulmonalen Hypertonie zu demonstrieren.11–13Darüber hinaus wurde zuvor berichtet, dass die Verabreichung von KER-012 in einer Dosis von 10 mg/kg eine maximale Zielbindung bewirkte (24KER-012 wird von naiven Ratten bis zu einer Dosis von 50 mg/kg gut vertragen, ohne dass Nebenwirkungen auftreten (25Daher wurde es nicht an Nx-Ratten evaluiert.Pulmonalarterien-Banding-Studie (PAB)Für das Modell der Pulmonalarterienbandierung (PAB) wurden in dieser Studie männliche C57BL/6-Mäuse (11–12 Wochen alt) des Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) verwendet. Kurz gesagt, die Mäuse wurden mit Isofluran-Inhalation (3 % bzw. 1,5 % in Sauerstoff) anästhesiert und aufrechterhalten. Die PAB-Operation wurde an den anästhesierten Mäusen durchgeführt, indem eine Nahtligatur um die Pulmonalarterie gelegt wurde, wie bereits beschrieben (26Die postoperative Schmerzlinderung erfolgte durch subkutane Gabe von Buprenorphinhydrochlorid (0,05–0,1 mg/kg) zweimal täglich über 3–5 Tage. Scheinoperierte Tiere wurden mit Vehikel ( n = 15) behandelt, während PAB-Mäuse entweder mit Vehikel ( n  = 14) oder mit RKER-012 ( n  = 15; 10 mg/kg; i.p.) zweimal wöchentlich über 3 Wochen  behandelt wurden .Präparation, Färbung und Analyse der NetzhautDie Augen wurden entnommen und 15 min in 4%igem Paraformaldehyd (Thermo Fisher, Kat.-Nr. J61899) fixiert. Anschließend wurden sie in Phosphatpufferlösung (PBS, pH 7,4) gespült und auf Eis gelegt. Die Retinae wurden präpariert, in Methanol (Fischer Scientific, Kat.-Nr. A452-4) überführt und bis zur Färbung bei −20 °C gelagert. Nach dem Entfernen des Methanols wurden die Retinae mit PBS gespült und anschließend 1 h in einem Permeabilisierungs- und Blockierungspuffer inkubiert. Dieser Puffer (Fischer Scientific, Kat.-Nr. 50-196-4397) wurde entfernt und durch AlexaFluor® GS-IB4-Isolectin (Thermo Fisher, Kat.-Nr. I21411) ersetzt. Die Mischung wurde über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Netzhäute wurden in Waschpuffer, PBS mit 0,3 % Triton (Thermo Fisher, Kat.-Nr. A16046.AP) gespült und anschließend mit Prolong-Eindeckmedium (Thermo Fisher, Kat.-Nr. P36930) für die Analyse präpariert. Die quantitative Analyse erfolgte an mit fluoreszierendem Isolectin angefärbtem Netzhautgewebe. Die Bilder der präparierten Netzhäute wurden mit einem ZEISS Axioscan 7 bei 5-facher Vergrößerung aufgenommen. Das Gefäßfrontverhältnis wurde als Quotient aus Gefäßradius (Abstand von der Papille zur Gefäßfront) und Netzhautradius (Abstand von der Papille zum Netzhautrand) quantifiziert. Alle Messungen wurden mit der Software ZEISS ZEN 3.8 durchgeführt.Vollständiges Blutbild und Beurteilung der BlutviskositätDas vollständige Blutbild wurde wöchentlich mit dem Hämatologie-Analysegerät Sysmex XN-1000 (Sysmex, Lincolnshire, IL) anhand von über die Schwanzvene entnommenen Blutproben (100–150 µL) untersucht. Die Blutviskosität wurde durch Messung der optischen Dichte bei 700 nm mit einem Spektralphotometer bestimmt.EchokardiographieDie Herzfunktion wurde mittels transthorakaler Echokardiographie (GE NextGen Logiqe, 22 MHz linearer Schallkopf) an leicht anästhesierten PAB- oder scheinoperierten Mäusen, wie bereits beschrieben, beurteilt (27Die Narkose wurde mit Isofluran-Inhalation (3 % bzw. 1,5 % in Sauerstoff) eingeleitet und aufrechterhalten. Die Dicke der freien Wand des rechten Ventrikels (RVFWT) wurde mittels M- und B-Mode-Echokardiographie in der links parasternalen Längsachse gemessen. Für jede Maus wurden drei bis fünf Herzschläge gemittelt. Die Untersuchungen und Analysen wurden von Untersuchern durchgeführt, die hinsichtlich der Behandlungen verblindet waren.Messung des systolischen PulmonalarteriendrucksDie Ratten wurden mit Ketamin/Xylazin (40–80/10 mg/kg) anästhesiert. Anschließend wurde ein Schnitt am Hals durchgeführt und die Vena jugularis anterior isoliert und ligiert. Ein mit Flüssigkeit gefüllter Druckkatheter wurde in die rechte Vena jugularis in Richtung des rechten Ventrikels eingeführt und bis zur Pulmonalarterie vorgeschoben, um den Pulmonalarteriendruck (PAP) wie zuvor beschrieben zu messen (28Der systolische Pulmonalarteriendruck (sPAP) wurde mithilfe des Notocord HEM-Datenerfassungssystems (InStem, USA) über einen Zeitraum von etwa 5–10 Minuten überwacht, bis stabile Messwerte erreicht waren. Nach Abschluss des terminalen Eingriffs wurde unter tiefer Ketamin/Xylazin-Narkose die Blutentnahme durchgeführt und Herz und Lunge en bloc entnommen.Zur Bestätigung des erhöhten Pulmonalarteriendrucks infolge einer Pulmonalarterienblutung wurde bei Mäusen eine Rechtsherzkatheteruntersuchung durchgeführt. Kurz gesagt, wurde bei den Mäusen am Ende des Experiments eine Anästhesie mit Isofluran-Inhalation (3 % bzw. 1,5 % in Sauerstoff) eingeleitet und aufrechterhalten. Die Atmung wurde mit einem Kleintierbeatmungsgerät unterstützt. Es wurde ein Schnitt in der Mittellinie des Oberbauchs gesetzt und das Zwerchfell eröffnet, um das Herz freizulegen. Ein 1,1 French großer, fester Millar-Katheter wurde von der Herzspitze aus in den rechten Ventrikel eingeführt, um den systolischen Pulmonalarteriendruck zu messen. Am Ende des Experiments wurde unter tiefer Isofluran-Narkose eine Aderlassbehandlung durchgeführt und Herz und Lunge en bloc entnommen.Messung der HerzfibroseDie Herzen wurden in 10% neutral gepuffertem Formalin (NBF) fixiert, in Paraffin eingebettet und in 6 µm dicke Schnitte geschnitten, wie bereits beschrieben (29Ein Mittelschnitt pro Herz wurde mit Masson-Trichrom gefärbt. Die fibrotische blaue Fläche und die Gesamtfläche wurden mittels computergestützter Planimetrie (ImageJ, NIH) vermessen. Die fibrotische Fläche wurde als prozentualer Anteil der Gesamtfläche angegeben. Pro Herz wurden drei zufällig ausgewählte Bildfelder ausgewertet und der Mittelwert berechnet. Insgesamt wurden 30–40 Bildfelder pro Gruppe vermessen, wobei der Untersucher die Herkunft der Herzschnitte nicht kannte.LungenhistopathologieZur Bestimmung des Ausmaßes des pulmonalen Remodellings wurden die Lungen mit 10% neutral gepuffertem Formalin (NBF) perfundiert, 48 h fixiert und anschließend in 70% Ethanol überführt. Die Lungen wurden in Paraffin eingebettet und in 5 µm dicke Schnitte geschnitten. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt und immunhistochemisch auf αSMA (Abcam-Kaninchen-polyklonaler Anti-α-Smooth-Muscle-Actin-Antikörper; ab5694, sichtbar gemacht mit DAB) mit einer Elastin-Gegenfärbung untersucht. Die H&E-gefärbten Präparate wurden hinsichtlich histopathologischer Befunde wie alveolärer Entzündung, perivaskulärer/vaskulärer Entzündung, Gefäßnekrose/Thrombose und Hypertrophie der glatten Muskulatur kleiner Arteriolen untersucht und auf einer Skala von 0–4 bewertet. Anhand von α -SMA/Elastin-gefärbten Präparaten wurden 100 Arteriolen pro Tier mit einem Durchmesser zwischen 10 µm und 50 µm als vollständig muskulär, teilweise muskulär oder nicht muskulär kategorisiert. Der Pathologe war während der Präparatauswertung hinsichtlich des Studiendesigns verblindet. Für die 3-plex-Immunfluoreszenzfärbung (IF) von CD31+SMA+CTGF in formalinfixiertem, paraffineingebettetem (FFPE) Rattenlungengewebe wurde die Färbung auf der Leica Bond RX-Plattform durchgeführt. Zur Antigenrückgewinnung wurden die Präparate 2 h bei 70 °C in einem Citratpuffer (pH 6) erhitzt und anschließend 45 min mit einem CD31-Antikörper (1:100, Abcam, Kat.-Nr. ab182981) inkubiert. Die Bindung des CD31-Antikörpers wurde mittels eines HRP-konjugierten sekundären Anti-Kaninchen-Polymers nachgewiesen. Anschließend erfolgte eine Signalverstärkung mit Opal 690-Reagenz (Tyramid) zur Visualisierung mittels Immunfluoreszenz. Zur Entfernung des Antikörpers aus der ersten Inkubationsrunde wurde eine zweite Antigen-Retrieval-Behandlung mit einem Citratpuffer (pH 6) für 25 min bei 94 °C durchgeführt. Der zweite primäre Antikörper, SMA (1:2000, Abcam, Kat.-Nr. ab124964), wurde für 30 min inkubiert. Die Antikörperbindung wurde erneut mittels eines HRP-konjugierten sekundären Anti-Kaninchen-Polymers und anschließender Signalverstärkung mit Opal 570-Reagenz (Tyramid) nachgewiesen. Zur Entfernung des Antikörpers aus der zweiten Inkubationsrunde wurde eine dritte Antigen-Retrieval-Behandlung mit einem EDTA-Puffer (pH 9) für 25 min bei 94 °C durchgeführt. Der dritte primäre Antikörper, CTGF (1:200, Abcam, Kat.-Nr. ab227180), wurde 30 min inkubiert. Die Antikörperbindung wurde mittels eines HRP-konjugierten sekundären Anti-Kaninchen-Polymers und anschließender Tyramid-Signalverstärkung mit Opal 520 Reagenz nachgewiesen. Spektrales DAPI (Akoya Biosciences, Kat.-Nr. FP1490) diente zur Visualisierung der Zellkerne. Die IF-Präparate wurden mit dem automatisierten quantitativen Pathologie-Bildgebungssystem PhenoImager™ HT (Akoya Biosciences®) bei einer Auflösung von 500 nm/Pixel und einem Luftobjektiv mit einer numerischen Apertur von 0,75 aufgenommen. Die Belichtungszeiten wurden für jeden Fluoreszenzkanal optimiert, um Emissionslicht innerhalb des linearen dynamischen Bereichs der Detektionskamera zu erfassen. Gepulste LEDs dienten der Anregung des Fluorophors, und eine Kombination aus Anregungs- und Emissionsfiltern eliminierte unerwünschtes Übersprechen zwischen den Kanälen.quantitative Echtzeit-PCRDie Gesamt-RNA wurde aus gefrorenem linkem Lungengewebe und rechtem Ventrikel isoliert und in TRIzol-Reagenz mit dem Zymo RNA Miniprep Kit (Zymo Research, Kat.-Nr. R2052) homogenisiert. RNA-Konzentration und -Qualität wurden mit dem Nanodrop One (Thermo Scientific, Kat.-Nr. 13-400-525) bestimmt. 250–500 ng Gesamt-RNA wurden mit dem QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen, Kat.-Nr. 205313) in cDNA umgeschrieben. Die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde mit 4 ng cDNA und der PowerUp SYBR Green Master Mix (ThermoFisher, Kat.-Nr. A25741) durchgeführt. Die relative Expression jedes Zielgens wurde mit der ΔΔCT -Methode bestimmt und auf die relative Expression von TBP, 36B4 oder B2 m normalisiert. Die Primersequenzen sind in  der ergänzenden Tabelle S1  aufgeführt . Proben mit unzureichender Menge oder Qualität wurden von der Analyse ausgeschlossen.Serumanalyse aus der Phase-1-StudieSerumproben aus einer Phase-1-Studie (ACTRN12621001077853) mit gesunden postmenopausalen Frauen, die entweder eine Einzeldosis KER-012 (4,5 mg/kg) oder Placebo erhielten, wurden einer umfassenden proteomischen Analyse des Serums unterzogen. Die Studien mit menschlichen Probanden wurden von der Ethikkommission für Humanforschung von Nucleus Network Pty Ltd Alfred Health (The Alfred, 55 Commercial Rd., Melbourne, Victoria, Australien, 3004) genehmigt. Die Studien wurden in Übereinstimmung mit den lokalen Gesetzen und institutionellen Vorgaben durchgeführt, und alle Teilnehmerinnen gaben ihre schriftliche Einwilligung nach Aufklärung.Die untersuchten Serumproben stammten von Probanden, die  am Tag 1 (vor der Behandlung, als Baseline betrachtet) und Tag 15 ein Placebo ( n = 5) erhielten, sowie von Probanden, die  am Tag 1 (vor der Behandlung, als Baseline betrachtet), Tag 7, Tag 15, Tag 22 und Tag 29 KER-012 in einer Dosis von 4,5 mg/kg ( n = 6) erhielten. Alle Proben wurden mit der SomaScan®-Plattform (SomaScan® Proteomics) (  www.somalogic.com  ) (SomaLogic®, Boulder, CO) analysiert. Diese Plattform enthält 7.596 Aptamere (6.408 humane Proteinanalyten) und ermöglicht die Messung der relativen Bindung der Serumprobe an jedes Aptamer in relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU). Kalibrierungs- und Normalisierungsproben wurden gemäß dem empfohlenen Protokoll des Herstellers verwendet. Die Datenstandardisierung erfolgte gemäß den Qualitätskontrollprotokollen der SomaScan®-Plattform. Um die Ergebnisse des SomaScan-Assays zu standardisieren, wurden zunächst die Rohdaten des SomaScan-Assays normalisiert, um Hybridisierungsvariationen innerhalb eines Laufs zu beseitigen (Hybridisierungsnormalisierung). Anschließend erfolgte eine Median-Signalnormalisierung über alle Proben hinweg, um andere Assay-Verzerrungen innerhalb des Laufs zu beseitigen.SomaScan-DatenanalyseVierzig Serumproben wurden an SomaLogic, LLC, zur Messung von 6.408 Proteinen mittels SomaScan-Multiplex-Assay eingesandt. Für diese Analyse wurden SOMAmer-Reagenzien (Aptamere), die mit einem photospaltbaren Linker und Biotin markiert waren, auf Streptavidin-beschichteten Beads immobilisiert. Jede Serumprobe wurde mit den Reagenzien inkubiert, wodurch Serumproteine ​​binden und SOMAmer-Zielprotein-Komplexe bilden konnten. Nicht gebundene Proteine ​​wurden abgewaschen, und gebundene Proteine ​​wurden mittels UV-Licht photochemisch gespalten, sodass nur die Reagenzien, die die ehemals gebundenen Proteine ​​repräsentierten, zurückblieben. Die Reagenzien wurden anschließend an komplementäre Sequenzen von DNA-Hybridisierungssonden auf einem Mikroarray gebunden. Die Sonden wurden dann mittels Fluoreszenz quantifiziert. Das Ergebnis wurde in relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) gemessen und ist direkt proportional zur Menge des Zielproteins in der ursprünglichen Serumprobe.Die Ergebnisse des SomaScan-Assays dienten der Korrektur systematischer Effekte, die während der DNA-Hybridisierung entstanden. Eine vor der Hybridisierung in den Assay eingeführte Kontrollsequenz wurde verwendet, um einen Skalierungsfaktor zu berechnen, und jede Probe wurde auf diesen Faktor normalisiert. Zusätzlich ermöglicht die Mediannormalisierung den Vergleich der Signale innerhalb einer Platte, indem assay- oder probenbedingte Schwankungen der Gesamtproteinkonzentration korrigiert werden. Schließlich wurde die mittlere Signalintensität jedes Subarrays zur Berechnung eines probenbasierten Skalierungsfaktors verwendet.Statistische Analyse von SomaScanFür alle Proben dieser Studie wurden Qualitätskontrollen und explorative Datenanalysen durchgeführt. Die Normalisierung der Hybridisierungskontrolle, die Normalisierung des Mediansignals innerhalb der Platte, die Normalisierung des Mediansignals auf eine humane Serumreferenz sowie die Plattenkalibrierung und -skalierung wurden von SomaLogic durchgeführt. Alle Proben bestanden die anfänglichen Qualitätskontrollen von SomaLogic hinsichtlich Normalisierung und Kalibrierung (Daten nicht gezeigt).Das R-Paket „readat“ (Cotton et al., 2016, BMC Bioinformatics) wurde zum Einlesen der SomaScan-Intensitätsdaten verwendet. Die Qualitätskontrolle der Proteomprofile erfolgte mittels vier automatisierter Ausreißertests und manueller Überprüfung der MA- und Dichtediagramme. Keine Probe fiel bei den automatisierten Ausreißertests durch.Die Normalisierung der Ausgangswerte erfolgte durch Zusammenführung der Placebo-Proben von Tag 1 und Tag 15 sowie der KER-012-Proben von Tag 1 zu einer Basisgruppe. Diese Basisgruppe wurde anschließend mit den kombinierten KER-012-Proben von Tag 7, Tag 15, Tag 22 und Tag 29 verglichen. Die Modelle wurden in R mithilfe des limma-Pakets angepasst und die logFC-Werte für den Vergleich zwischen Placebo und Medikament extrahiert.Statistische AnalyseDie statistischen Analysen wurden mit der Software GraphPad Prism (Prism v10, GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) durchgeführt. Statistische Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen wurden mittels ungepaartem t-Test für unabhängige Stichproben oder einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) mit anschließendem Post-hoc -Test (bei Vergleich von mehr als zwei Gruppen) untersucht. Ein p-Wert  < 0,05 wurde für alle statistischen Analysen als signifikant angesehen. Statistische Ausreißer wurden mit dem Grubbs-Test entfernt.ErgebnisseKER-012 zeigte selektive TGF-β-Ligandenbindung und -hemmung.KER-012 besteht aus einer modifizierten extrazellulären Domäne (ECD) von ActRIIB, die über einen (Gly)₃-Linker mit der konstanten Region von humanem IgG1 fusioniert ist. RKER-012 besitzt eine murine IgG2a-Fc-Domäne anstelle der humanen IgG1-Fc-Domäne, die in KER-012 vorkommt. KER-012 und RKER-012 besitzen dieselbe ECD, die für die Ligandenbindung verantwortlich ist (  Abbildung 1A  ). RKER-012 ist ein Forschungsanalogon von KER-012 und wird in präklinischen Studien an Nagetieren eingesetzt, um die Entwicklung von Antikörperreaktionen gegen das Medikament zu minimieren. In  Abbildung 1A  sind KER-012 und RKER-012 mit AlphaFold modelliert.30) und werden als Oberflächenrepräsentation dargestellt. Um die strukturelle Grundlage der einzigartigen Bindung und Potenz von KER-012 zu untersuchen, wurde eine Strukturmodellierung durchgeführt. Die Ausrichtung des mit AlphaFold vorhergesagten Modells der KER-012/RKER-012-ECD, die eine Sequenzidentität von 91,3 % mit der Wildtyp-ActRIIB-ECD aufweist, zeigte eine ähnliche Gesamtfaltung im Vergleich zu bekannten Kristallstrukturen der ActRIIB-ECD (PDB: 4FAO) (31) und ActRIIA ECD (PDB: 7U5P) (32), mit mittleren quadratischen Abweichungen (RMSD) von 0,389 bzw. 0,559 (  Abbildung 1B  ). Elektrostatische Potentialkarten der ECDs von ActRII(A/-Rezeptoren und KER-012/RKER-012, erstellt mit PyMOL (33Abbildung  1C  zeigte, dass KER-012/RKER-012 eine relativ hohe positive Ladung an der Rezeptor-Ligand-Grenzfläche aufweist, ein Merkmal, das bei ActRIIA oder ActRIIB nicht beobachtet wird. Auch BMP9 zeigt eine hohe positive Ladung in der Region, die mit dem Rezeptor interagiert (  Abbildung 1D  ), was darauf hindeutet, dass elektrostatische Abstoßung die Bindung von BMP9 an KER-012/RKER-012 verringern könnte.Abbildung 1https://www.frontiersin.org/files/Articles/1827438/xml-images/fcvm-13-1827438-g001.webpKER-012 zeigte eine unterschiedliche TGF-β-Ligandenbindung und zellbasierte Funktion. (A) Schematische Darstellung der KER-012- und RKER-012-Ligandenfalle, die die modifizierte extrazelluläre Domäne (ECD) von ActRIIB in Grün und die konstante Region des Antikörpers in Lila für KER-012 und Blau für RKER-012 zeigt. ( Die Röntgenstruktur der an BMP9 gebundenen ActRIIB-ECD (PDB-ID: 4FAO (31)), ausgerichtet an die Kristallstruktur von ActRIIA ECD (PDB-ID: 7U5P (32)) und das von AlphaFold generierte Modell (30(C) Elektrostatische Potenzialkarten der extrazellulären Domänen ( ECD) von ActRIIA, ActRIIB und KER-012/RKER-012, erstellt mit PyMOL. Unterschiede (schwarzer Kreis) in der Verteilung des elektrostatischen Potenzials an der Rezeptorbindungsstelle sind hervorgehoben. (D) Elektrostatische Potenzialkarte von BMP9, erstellt mit PyMOL. Der Bereich innerhalb der Rezeptor-Ligand-Grenzfläche ist hervorgehoben. In der elektrostatischen Potenzialkarte kennzeichnet Rot negatives und Blau positives Potenzial. Weiße Bereiche entsprechen neutralen Potenzialen. (E) Bindungsselektivität von KER-012 gegenüber relevanten TGF-β-Liganden im Vergleich der SMAD 1/5/9- und SMAD 2/3-Signalwege mit den Wildtyp-ECDs von ActRIIA und ActRIIB. (F) SPR-basierte Bindungsaffinitäten und zellbasierte IC50- Werte von KER-012 für ausgewählte TGF-β-Liganden. (G) Repräsentative zellbasierte Hemmkurve, die die prozentuale Hemmung der Signalübertragung als Funktion der KER-012-Konzentration in Gegenwart ausgewählter TGF-β-Liganden zeigt. Die erste Charakterisierung von KER-012 mit Activin A mittels Negativkontrast-Elektronenmikroskopie ermöglichte die Aufklärung von Strukturmerkmalen mit niedriger Auflösung und der Bindungsorientierung (  Ergänzende Abbildung 1B  ). Diese Daten legen nahe, dass ein einzelnes KER-012-Molekül an ein Homodimer von Activin A bindet. Das Bindungsaffinitätsprofil von KER-012 wurde mit Wildtyp-Ligandenfallen auf Basis von ActRIIA und ActRIIB sowohl für Off-Target- (BMPs) als auch für On-Target-Liganden (Activine und GDFs) verglichen (  Abbildung 1E  ). Die Heatmap der Bindungsaffinität zeigte für jede Ligandenfalle ein spezifisches Bindungsmuster. KER-012 zeigte eine minimale Bindung an BMP-(2, 3, 4, 6, 9), jedoch eine moderate bis starke Bindung an BMP-(5, 7, 10). Der auf ActRIIA basierende Ligandenfänger zeigte eine schwächere Bindung an BMP-(2, 3, 4, 9), bevorzugte jedoch BMP-(5, 6, 7, 10) deutlich. KER-012 wies im Vergleich zu ActRIIA und ActRIIB die geringste Bindungsaffinität zu BMP-9 auf. Alle getesteten Ligandenfänger zeigten jedoch eine ähnlich starke Bindung an die Zielproteine ​​Activin (A, und GDF (8, 11), während die Bindung an Activin C schwach war. Die SPR-Bindungscharakterisierung bestätigte, dass KER-012 die Bindung an Activin-(A, und GDF-11 mit pikomolarer Affinität beibehielt (  Abbildung 1F  ), ähnlich den Wildtyp-Ligandenfängern ActRIIA und ActRIIB (  Abbildung 1E  ), während die Bindung an BMP-9 schwächer war (  Abbildung 1F  ). In Luciferase-Reporter-basierten zellulären Assays für die SMAD2/3- und SMAD1/5/9-Signalwege hemmte KER-012 die durch Activin-(A, und GDF-11 induzierte SMAD2/3-Signalübertragung stark, war jedoch bei der Hemmung der BMP9-induzierten SMAD1/5/9-Signalübertragung deutlich weniger wirksam – etwa 785- bis 2000-fach im Vergleich zu anderen getesteten TGF-β-Liganden (  Abbildung 1F  ). Eine repräsentative Hemmkurve (  Abbildung 1G  ) veranschaulicht die relative Wirksamkeit von KER-012 gegenüber ausgewählten TGF-β-Liganden. Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass KER-012 ein spezifisches Bindungs- und Wirkungsprofil gegenüber TGF-β-Liganden aufweist, das sich signifikant von dem der Wildtyp-Ligandenfänger auf ActRIIA- und ActRIIB-Basis unterscheidet.Des Weiteren zeigte der Sequenzvergleich von Activinen, GDFs und BMP-Liganden deutliche Unterschiede in den Aminosäureresten an der Rezeptor-Ligand-Bindungsstelle, wie sie durch die bekannte ActRIIB:BMP9-Struktur vorhergesagt wurden (  Ergänzende Abbildung S2  ). Diese inhärenten Variationen in den TGF-β-Ligandensequenzen innerhalb der Rezeptor-Ligand-Bindungsstelle könnten die unterschiedlichen Bindungsaffinitäten von Liganden zu Wildtyp- und modifizierten ActRII-basierten Ligandenfängern erklären.RKER-012 übt in vivo BMP-sparende Eigenschaften aus.Frühere Berichte über neonatale Mausmodelle der retinalen Angiogenese haben elegant gezeigt, dass die BMP/ALK1-Signalgebung für die Entwicklung der retinalen Gefäße von entscheidender Bedeutung ist (34,35Anhand dieses Modells, wie in  Abbildung 2A  dargestellt , evaluierten wir die BMP-schonenden Eigenschaften von RKER-012, einem Forschungsanalogon von Cibotercept (KER-012), und RAP-011, einem Forschungsanalogon von Sotatercept. Activin-Rezeptor-ähnliche Kinase 1 (ALK1-hFc), ein Ligandenfänger für BMP9 und BMP10 (36,37) wurde als Positivkontrolle für Gefäßstörungen einbezogen. Das Gefäßfrontverhältnis wurde, wie in  Abbildung 2A  dargestellt, quantifiziert , um den Effekt der BMP/ALK1-vermittelten Hemmung der Gefäßentwicklung zu beurteilen. Die Netzhäute von mit ALK1-hFc behandelten Jungtieren zeigten ungeordnete Netzwerke mehrschichtiger Blutgefäße und eine Reduktion des Gefäßfrontverhältnisses (  Abbildungen 2B,C  ). Dies deutet auf eine gestörte retinale Gefäßentwicklung (DRVD) hin und stimmt mit früheren Berichten überein (35RAP-011, der ActRIIA-Ligandenfänger, führte zu einer dosisabhängigen Reduktion des Gefäßfrontverhältnisses, was möglicherweise auf eine beeinträchtigte Gefäßentwicklung hindeutet. Bei einer Dosis von 20 mg/kg wiesen die mit RAP-011 behandelten Jungtiere signifikant niedrigere  Gefäßfrontverhältnisse ( p ≤ 0,001) auf als die Kontrollgruppe (  Abb. 2B, C  ). Im Gegensatz dazu zeigten die mit RKER-012 behandelten Jungtiere sowohl bei 10 als auch bei 20 mg/kg signifikant höhere Gefäßfrontverhältnisse als die mit ALK1-hFc (Positivkontrolle) und RAP-011 behandelten Mäuse (  Abb. 2B, C  ). Tatsächlich unterschieden sich die Gefäßfrontverhältnisse der mit RKER-012 behandelten Gruppe nicht von denen der Kontrollgruppe. Das Fehlen von DRVD bei Mäusen, die mit RKER-012 in Dosen von 10 mg/kg und 20 mg/kg behandelt wurden, lässt darauf schließen, dass RKER-012 das BMP/ALK1-abhängige Gefäßwachstum nicht hemmte, was mit den in vitro beobachteten BMP-schonenden Eigenschaften von RKER-012 übereinstimmt, wie in  den Abbildungen 1E–G  gezeigt .Abbildung 2https://www.frontiersin.org/files/Articles/1827438/xml-images/fcvm-13-1827438-g002.webpRKER-012 zeigte in vivo BMP-schonende Eigenschaften . (A) Experimenteller Ansatz zur Untersuchung der Wirkung von RKER-012 auf die retinale Neovaskularisation bei C57BL/6-Jungtieren. Die Jungtiere wurden am 1. und 3. postnatalen Tag (P1 und P3) subkutan mit Vehikel ( n = 4), ALK1-hFc (10 mg/kg, n =  9 )  , RAP-011 (10 mg /kg, n =  5 und 20 mg /kg, n  = 4) oder RKER-012 (10 mg/kg, n  = 5 und 20 mg/kg, n  = 4) behandelt. Am 8. postnatalen Tag (P8) wurden die Jungtiere getötet, und die isolierten Retinae wurden präpariert und mit Isolectin-B4 gefärbt, um die Gefäße darzustellen und den Gefäßplexus zu vermessen. Die Mortalitätsrate der mit ALK1-hFc behandelten Jungtiere betrug 55 %. Die Netzhäute der überlebenden Jungtiere waren extrem fragil und wiesen eine erhöhte Steifigkeit auf, was aufgrund technischer Schwierigkeiten zu Probenverlusten führte. Nur eine Netzhaut bestand die Qualitätskontrolle für die nachfolgende Färbung und Analyse. Die Gefäßfrontverhältnisse (das Verhältnis des Gefäßradius zum Netzhautradius) wurden zwischen der Vehikelkontrollgruppe und allen anderen Gruppen verglichen. ( Repräsentative Netzhautbilder von neonatalen Mäusen, die mit ALK1-hFc (10 mg/kg), RAP-011 (10 mg/kg und 20 mg/kg) und RKER-012 (10 mg/kg und 20 mg/kg) behandelt wurden. (C) Quantifizierung des Gefäßfrontverhältnisses. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Die Analyse erfolgte mittels einfaktorieller ANOVA mit anschließendem Tukey-Test für Mehrfachvergleiche: ns: nicht signifikant; ** p  ≤ 0,01; *** p  ≤ 0,001.Das durch Erythrozytose vermittelte Hyperviskositätssyndrom verschlimmert Blutungen in einem Sugen-Hypoxie-RattenmodellKER-012/RKER-012 löste bei nicht-humanen Primaten (  Ergänzende Abbildung S3A  ) und SuHx-Ratten (  Ergänzende Abbildung S3B  ) keine Erythrozytose aus. Sotatercept hingegen löst eine Erythrozytose aus (38–40Um festzustellen, ob ein erhöhtes Erythrozytenvolumen und die Entwicklung eines Hyperviskositätssyndroms das Blutungsrisiko verstärken könnten, wie in der Sotatercept-Kennzeichnung angegeben (16An einem SuHx-Rattenmodell wurde die durch EPO induzierte, erythrozytosebedingte Hyperviskosität und das erhöhte Blutungsrisiko untersucht (siehe  Abbildung 3A  ) . Wie in  den Abbildungen 3B–D  dargestellt , führte die EPO-Behandlung im Vergleich zu unbehandelten Nx-Kontrollen zu einem Anstieg der Erythrozytenzahl [SuNx-EPO: +41 %, p  < 0,0001; SuHx-EPO: +24 %, p  < 0,01] und des Hämoglobinwerts [SuNx-EPO: +35 %, p  < 0,0001; SuHx-EPO: +37 %, p  < 0,0001] sowie zu einem Abfall der Thrombozytenzahl [SuNx-EPO: -77 %, p  < 0,0001; SuHx-EPO: -194 %, p  < 0,0001]. Eine erhöhte Erythrozytose [r = 0,6604, p  < 0,0001] und ein erhöhter Hämoglobinwert [r = 0,6813, p  < 0,0001] korrelierten positiv mit einer erhöhten Blutviskosität (  Abb. 3E  bzw. 3F).  Abbildung 3G und 3H  zeigen gastrointestinale Blutungen und Nasenbluten bei SuHx-EPO-Ratten. Obwohl SuNx-EPO-Ratten eine erhöhte Anzahl roter Blutkörperchen aufwiesen, wurden keine Blutungsereignisse beobachtet. Darüber hinaus war die Thrombozytopenie bei SuHx-EPO im Vergleich zu SuNx-EPO stärker ausgeprägt. Gleichzeitig wurden bei SuHx-EPO-Ratten erhöhte Erythrozytenzahlen, eine erhöhte Blutviskosität, eine schwere Thrombozytopenie und Blutungsereignisse beobachtet, was mit einer reduzierten Überlebensrate [−62,5 %, p  < 0,0001] einherging (  Abb. 3I  ). Diese Daten belegen, dass Hypoxie bei Sugen-Ratten die Anfälligkeit für HVS-bedingte Blutungen und Mortalität als Reaktion auf EPO-induzierte Erythrozytose und schwere Thrombozytopenie erhöhte. Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse, dass eine erhöhte Blutviskosität, die teilweise auf eine gesteigerte Erythrozytose zurückzuführen ist, zusammen mit einer begleitenden schweren Thrombozytopenie das Blutungsrisiko bei Patienten mit chronischen Erkrankungen, die mit systemischer Hypoxie einhergehen, wie z. B. PAH, potenziell erhöhen kann. Ein modifizierter ActRIIB-Fc-Ligandenfänger, wie z. B. KER-012/RKER-012, der keine Erythrozytose auslöst, könnte daher das Risiko eines Hyperviskositätssyndroms verringern.Abbildung 3https://www.frontiersin.org/files/Articles/1827438/xml-images/fcvm-13-1827438-g003.webpDas durch Erythrozytose bedingte Hyperviskositätssyndrom verschlimmerte Blutungen im Sugen-Hypoxie-Rattenmodell. (A) Experimenteller Ansatz zur Untersuchung, ob die Kombination von Erythrozytose und Thrombozytopenie Blutungen im Sugen-Hypoxie-Rattenmodell verstärkt. Blutspiegel von ( Erythrozyten ( rote Blutkörperchen , RBCs), (C) Hämoglobin (HGB) und (D) Thrombozyten (PLT). Die Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Die Analyse erfolgte mittels einfaktorieller ANOVA mit anschließendem Sidak-Test für multiple Vergleiche. Die p- Werte sind wie folgt gekennzeichnet: * p  < 0,05, ** p  < 0,01, **** p  < 0,0001. Hx: Hypoxie, TIW: dreimal wöchentlich. (E) Positive Korrelation zwischen der Anzahl der Erythrozyten und der relativen Blutviskosität. (F) Positive Korrelation zwischen HGB und der relativen Blutviskosität. Die statistische Analyse erfolgte mittels Pearson-Korrelationstest. Pathologische Beobachtungen von (G) Nasenbluten während des Lebens und (H) gastrointestinalen Blutungen bei der terminalen Nekropsie von Ratten, die Sugen5416 und EPO unter Hypoxie erhielten. (I) Die Kaplan-Meier-Überlebenskurve zeigte, dass die Überlebensrate der Ratten in der SuHx-EPO-Gruppe im Vergleich zur Nx-Gruppe signifikant reduziert war. In den anderen Gruppen wurde keine Mortalität beobachtet.RKER-012 übt in einem Sugen-Hypoxie-Rattenmodell der PAH schützende Wirkungen auf kardiopulmonale Parameter aus.Berichte aus dem SuHx-Rattenmodell der PAH haben gezeigt, dass RAP-011, ein ActRIIA-Fc-Forschungsanalogon von Sotatercept, schützende Wirkungen auf kardiopulmonale Parameter ausübt (11,12In dieser Studie untersuchten wir die Wirkung von RKER-012, einem modifizierten ActRIIB-Fc-Ligandenfänger, im SuHx-Rattenmodell der pulmonalen arteriellen Hypertonie (PAH). Wir untersuchten, ob RKER-012 die Entwicklung eines erhöhten systolischen pulmonalarteriellen Drucks (sPAP) und einer Hypertrophie des rechten Ventrikels (RV) hemmen kann. Männlichen Sprague-Dawley-Ratten wurde eine Einzeldosis Sugen 5416 subkutan injiziert und sie wurden drei Wochen lang einer 10%igen Hypoxie ausgesetzt. Während dieser Zeit erhielten sie entweder Vehikel (SuHx-Veh) oder alle zwei Wochen 10 mg/kg RKER-012 (SuHx-RKER-012), wie in  Abbildung 4A  dargestellt . Kontrollratten wurden drei Wochen lang unter Normoxie (ca. 21 % O₂) gehalten und mit Vehikel behandelt (Nx-Veh). Nach dreiwöchiger Behandlung mit Vehikel oder RKER-012 wurden die Ratten hinsichtlich ihrer kardiopulmonalen Phänotypen untersucht. SuHx-Veh-Ratten zeigten im Vergleich zu Nx-Veh-Ratten eine signifikant erhöhte Dicke der Pulmonalarterienwand (  Abb. 4B  ) [ p  ≤ 0,0001], einen erhöhten systolischen Pulmonalarteriendruck (sPAP) [+252,2 %; p ≤  0,0001] (  Abb. 4C  ) und eine verstärkte Rechtsherzhypertrophie [+99,4 %; p  ≤ 0,0001] (  Abb. 4D  ). SuHx-Ratten, die mit RKER-012 behandelt wurden, wiesen hingegen eine signifikant verringerte Dicke der Pulmonalarterienwand [ p  ≤ 0,0001] (  Abb. 4B  ), einen signifikant niedrigeren sPAP [−37,4 %; p ≤ 0,0001] (Abb. 4C) und eine signifikant verringerte Rechtsherzhypertrophie [−24,8 %; p  ≤ 0,0001] (  Abb. 4D ) auf.  p  = 0,0001] (  Abbildung 4D  ) im Vergleich zu SuHx-Veh. Darüber hinaus verstärkt die Normalisierung der Dicke der pulmonalen Arterienmuskelwand bei SuHX-RKER-012-Ratten auf diejenige von Nx-Veh-Ratten (  Abbildung 4B  ) im Gegensatz zu Vasodilatatoren die geweberemodellierende Wirkung des Activin-Rezeptor-Ligandenfängers, was auf eine Wiederherstellung des Gleichgewichts zwischen pro-proliferativen (Smad2/3) und anti-proliferativen (Smad1/5/9) Signalwegen hindeutet, wie bereits beschrieben (7,11Da Activin-Rezeptor-Ligandenfänger keine starke vasodilatatorische Wirkung haben, könnte die fehlende Normalisierung des systolischen pulmonalarteriellen Drucks (sPAP) bei SuHx-RKER-012-Ratten (  Abbildung 4C  ) möglicherweise auf einen persistierenden Resttonus der Gefäße zurückzuführen sein. Dieser Rest-sPAP könnte wiederum eine Rolle bei der fehlenden Normalisierung der rechtsventrikulären Hypertrophie bei SuHx-RKER-012-Ratten spielen (  Abbildung 4D  ). Dennoch zeigen diese Daten, dass RKER-012 in einem SuHx-Rattenmodell der pulmonalen arteriellen Hypertonie (PAH) vor der Entwicklung einer erhöhten Wanddicke der Pulmonalarterie, eines erhöhten sPAP und einer rechtsventrikulären Hypertrophie schützt.Abbildung 4https://www.frontiersin.org/files/Articles/1827438/xml-images/fcvm-13-1827438-g004.webpRKER-012 schwächt kardiale hämodynamische Parameter in einem Rattenmodell für pulmonale arterielle Hypertonie (PAH) unter Hypoxie ab. (A) Experimenteller Ansatz zur Untersuchung der Wirkung von RKER-012 auf die PAH-Abschwächung in einem Rattenmodell für pulmonale arterielle Hypertonie (PAH). Ratten wurden an Tag 0 mit einer Einzeldosis SU5416 (200 mg/kg, s.c.) behandelt und 3 Wochen lang Hypoxie (10 % O₂) ausgesetzt . Ratten, die SU5416 erhielten und Hypoxie ausgesetzt waren, wurden 3 Wochen lang zweimal wöchentlich mit RKER-012 (10 mg/kg, s.c.) oder Vehikel (TBS) behandelt. ( Muskelwanddicke der Pulmonalarterie (PA), (C) systolischer Pulmonalarteriendruck (sPAP) und (D) rechtsventrikuläre (RV) Hypertrophie, bestimmt anhand des Fulton-Index (Verhältnis des Gewichts des rechten Ventrikels (RV) zum Gewicht des linken Ventrikels (LV) und des Septums (S)) bei normoxischen Ratten, die mit Vehikel (Nx-Veh), SuHx-Veh oder RKER-012 (SuHx-RKER-012) behandelt wurden. n  = 5–12 pro Gruppe. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Die Analyse erfolgte mittels einfaktorieller ANOVA und Tukey- Post-hoc- Test (* p  < 0,05, *** p  < 0,001, **** p  < 0,0001).RKER-012 schwächt die Entwicklung der Gefäßmuskularisierung im SuHx-Modell ab.Die Muskularisierung nicht-muskulärer Arterien ist eines der Hauptmerkmale der pulmonalen arteriellen Hypertonie (PAH). Daher untersuchten wir die vaskuloprotektiven Effekte von RKER-012 auf die Muskularisierung nicht-muskulärer Lungenarterien im SuHx-Rattenmodell. Im Vergleich zu normoxischen Kontrolltieren (Nx-Veh) wiesen SuHx-Veh-Ratten signifikant mehr muskularisierte (partiell, p  = 0,0002; vollständig, p  ≤ 0,0001) und signifikant weniger nicht-muskularisierte ( p  ≤ 0,0001) Lungenarterien auf (  Abbildung 5B  ). Im Gegensatz dazu zeigten mit RKER-012 behandelte SuHx-Ratten signifikant weniger muskularisierte (partiell, p  = 0,0002; vollständig, p  ≤ 0,0001) Lungenarterien als SuHx-Veh-Ratten (  Abbildung 5B  ). Obwohl statistisch nicht signifikant,  zeigte sich bei den mit RKER-012 behandelten SuHx-Ratten ein steigender Trend in den nicht-muskularisierten Arterien ( p = 0,1215) (  Abb. 5B  ). Diese Unterschiede sind in den repräsentativen Bildern in  Abb. 5A  zu erkennen . Des Weiteren war die pulmonale Expression des Glattmuskelzellmarkers αSMA, Acta2 in SuHx-Veh-Ratten im Vergleich zu Nx-Veh-Ratten signifikant erhöht ( p  = 0,0003). Im Gegensatz dazu wiesen mit RKER-012 behandelte SuHx-Ratten  im Vergleich zu SuHx-Veh-Ratten eine reduzierte Expression von αSMA, Acta2 auf ( p = 0,0022) (  Abb. 5C  ). Zusätzlich war der Plasminogenaktivator-Inhibitor-1 (Pai1), ein Marker für vaskuläres Remodeling, in SuHx-Veh-Ratten erhöht ( p  ≤ 0,0001). Wichtig ist, dass SuHx-Ratten, die mit RKER-012 behandelt wurden,  im Vergleich zu SuHx-Veh-Ratten eine reduzierte Expression von Pai1 aufwiesen ( p ≤ 0,0001;  Abbildung 5D  ). Diese Ergebnisse zeigen, dass RKER-012 die Entwicklung der Gefäßmuskularisierung in einem SuHx-Rattenmodell der PAH abschwächte.Abbildung 5https://www.frontiersin.org/files/Articles/1827438/xml-images/fcvm-13-1827438-g005.webpRKER-012 schwächt das pulmonale Gefäßremodeling in einem experimentellen Rattenmodell für pulmonale arterielle Hypertonie (PAH) unter Sugenhypoxie ab. (A) Repräsentative Bilder von Lungenschnitten, gefärbt mit αSMA/Elastin, von normoxischen Ratten, die mit Vehikel (Nx-Veh) behandelt wurden, von Ratten unter Sugenhypoxie, die mit Vehikel (SuHx-Veh) behandelt wurden, und von Ratten unter Sugenhypoxie, die mit RKER-012 (SuHx-RKER-012) behandelt wurden. Die Pfeile in den linken Bildern markieren Lungengefäße, der rote Rahmen zeigt die vergrößerten Lungengefäße im rechten Bild. ( Muskularisierung der Lungengefäße, (C) Genexpressionsniveaus von α-glatter Muskelaktin (αSMA) Acta2 und (D) Plasminogenaktivator-Inhibitor-1 ( Pai-1) in den Lungen von Nx-Veh-, SuHx-Veh- und SuHx-RKER-012-Ratten. n  = 6–12 pro Gruppe. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Die Analyse erfolgte mittels einfaktorieller ANOVA und Tukey- Post-hoc- Test (** p  < 0,01, *** p  < 0,001, **** p  < 0,0001).RKER-012 mildert Veränderungen von Markern der Endothelfunktionsstörung und verhindert EndoMT.Endotheliale Dysfunktion und EndoMT sind Schlüsselfaktoren des pulmonalen Gefäßumbaus bei PAH. Die Oberfläche von Endothelzellen besteht aus verschiedenen Zelladhäsionsmolekülen, darunter E-Selektin, P-Selektin und vaskuläres Zelladhäsionsmolekül-1 (VCAM-1), die bekanntermaßen die Interaktion mit Leukozyten unter entzündlichen Bedingungen erleichtern und so die endotheliale Barrierefunktion beeinträchtigen, was zu weiterem Gefäßumbau und Krankheitsfortschritt führt.41Die Konzentrationen von E-Selectin und P-Selectin sind bei PAH-Patienten erhöht (42,43) und sind Indikatoren für eine Aktivierung und Funktionsstörung des Endothels (44Daher untersuchten wir die Wirkung von RKER-012 auf die Genexpression von Markern der endothelialen Dysfunktion und der EndoMT in den Lungen von SuHx-Ratten (  Abbildung 6  ). Spp1, sezerniertes Phosphoprotein 1, auch bekannt als Osteopontin, moduliert verschiedene zelluläre Prozesse, darunter Zellproliferation, Migration, Apoptose, extrazelluläre Matrixsynthese und Entzündung, durch Interaktion mit Integrinen und CD44, einem ubiquitär exprimierten Zelloberflächenrezeptor, um die EndoMT zu induzieren (45Es wurde berichtet, dass die zirkulierenden Spp1-Spiegel bei verschiedenen Formen der pulmonalen Hypertonie erhöht sind (45Ein Anstieg der pulmonalen Expression von Spp1 bei PAH-Patienten korreliert stark mit dem Schweregrad der Erkrankung (46In ähnlicher Weise spielt der Bindegewebswachstumsfaktor (Ctgf), ein Matrixprotein, eine wesentliche Rolle bei der Geweberegeneration und Fibrose, einschließlich der Aktivierung von Myofibroblasten, die aus EndoMT stammen (47In dieser Studie zeigte SuHx-Veh im Vergleich zu Nx-Veh eine signifikant erhöhte Expression von E-Selectin, Sele [ p  = 0,0003] (  Abbildung 6A  ), vaskulärem Zelladhäsionsmolekül-, Vcam-1 [ p  = 0,0102] (  Abbildung 6C  ), Bindegewebswachstumsfaktor, Ctgf [ p  < 0,05] (  Abbildung 6D  ) und Osteopontin, Spp1 [ p  = 0,0025] (  Abbildung 6E  ), mit einem starken Trend zu erhöhter P-Selectin, Slep [ p  = 0,0939] (  Abbildung 6B  ). Wichtig ist, dass die Lungen von SuHx-Ratten, die mit RKER-012 behandelt wurden (SuHx-RKER-012), im Vergleich zu SuHx-Veh-Ratten eine reduzierte Expression von E-Selectin [ p  <  0,0001] (  Abbildung  6A ),  P -Selectin [ p  < 0,0001] (  Abbildung 6B  ), Vcam-1 [ p  < 0,0001] (  Abbildung 6C  ), Ctgf [p = 0,0032] (Abbildung 6D) und Spp1 [ p  = 0,0038] (  Abbildung 6E  ) aufwiesen. Die gegensätzliche Beobachtung einer geringeren P-Selectin-Genexpression in mit RKER-012 behandelten SuHx-Ratten im Vergleich zu Nx-Veh-Ratten, anders als bei E-Selectin, könnte auf unterschiedliche Regulationsmechanismen zwischen E-Selectin und P-Selectin zurückzuführen sein. E-Selectin wird de novo synthetisiert , während P