Trimetazidin gegen PH?

Entschlüsselung der hemmenden Wirkung von Trimetazidin auf die Entwicklung von pulmonaler Hypertonie durch Verringerung der Fettsäureoxidation und Förderung der Glukoseoxidation
www.nature.com/articles/s41598-024-76100-x
AbstraktPulmonale Hypertonie (PH) ist eine verheerende Krankheit, die durch Gefäßumbau gekennzeichnet ist und zu Rechtsherzversagen und Tod führt. Eine Dysregulation des Energiestoffwechsels ist mit der Pathogenese von PH verbunden. Trimetazidin (TMZ), ein selektiver langkettiger 3-Ketoacyl-Coenzym-A-Thiolase-Hemmer, ist für die Aufrechterhaltung des Energiestoffwechsels von entscheidender Bedeutung. Trotz der angegebenen hemmenden Wirkung von TMZ auf den pulmonalen Gefäßumbau bei der Entwicklung von PH ist die integrierte Bewertung der Veränderungen von Biomolekülen wie Metaboliten und Transkripten, die TMZ in den Lungen- und Herzgeweben induziert, in vivo weitgehend unbekannt. Um den molekularen Mechanismus der Auswirkungen von TMZ auf die PH-Entwicklung besser zu verstehen, haben wir eine umfassende Analyse der Veränderungen der Herzmetaboliten und Lungentranskripte von mit TMZ behandelten SU5416-Hypoxie-Ratten (Su/Hx) durchgeführt. Eine metabolomische Analyse der Su/Hx-induzierten PH-Herzen zeigte, dass TMZ die Konzentration langkettiger Fettsäuren reduzierte. Darüber hinaus linderte TMZ den PH-Grad und die übermäßige Belastung der rechten Herzfunktion bei Ratten mit Su/Hx-induzierter PH. Wir identifizierten die Kandidaten-Zielgene für die TMZ-Behandlung während der PH-Entwicklung. Interessanterweise wurden die mRNA-Werte der Fettsäuretransporter durch die TMZ-Gabe in die Lungen mit Su/Hx-induzierter PH erheblich herunterreguliert. Insbesondere unterdrückte TMZ die übermäßige Proliferation menschlicher glatter Muskelzellen der Lungenarterie unter hypoxischen Bedingungen. Unsere Studie legt nahe, dass TMZ die PH-Entwicklung verbessert, indem es den Energiestoffwechsel in Lunge und Herz einbezieht.


 EinführungPulmonale Hypertonie (PH) ist ein pathologischer Zustand, der durch erhöhten pulmonalarteriellen Druck gekennzeichnet ist, der zu Hypertrophie und Versagen des rechten Ventrikels führt  1  und der eine gestörte Regulation der vaskulären Bestandteilszellen in den kleinen bis mittelgroßen distalen Pulmonalarterien zeigt, begleitet von einer Infiltration entzündlicher Zellen  2  . Daher besteht großes Interesse an der Entwicklung neuer therapeutischer Strategien mit Fokus auf dem Umbau des rechten Ventrikels und der pulmonalarteriellen Gefäße.Andererseits sind Stoffwechselstörungen in Lunge und Herz an der Pathogenese von PH beteiligt, obwohl Veränderungen im Stoffwechsel und der Bioenergetik je nach Zelltyp (Endothel- und glatte Muskelzellen) und Organ (Lunge und Herz) variieren  3.  Darüber hinaus wurden veränderte Stoffwechselwege, einschließlich Fettsäure- und Glukoseoxidation, Redoxreaktionen, der Tricarbonsäurezyklus und die Elektronentransportkette, mit der Pathogenese von PAH in Verbindung gebracht  4.  Es ist auch bekannt, dass kürzlich eine Beteiligung der metabolischen Umgestaltung an den Mechanismen entdeckt wurde, die den pathologischen Veränderungen in den PH-Gefäßen zugrunde liegen  5.  Interessanterweise besteht in menschlichen Zellen eine reziproke Beziehung zwischen Fettsäureoxidation und Glukoseoxidation (Randle-Zyklus)  6  . Darüber hinaus sind Carnitin, Dicarbonsäure und lang- und mittelkettige freie Fettsäureprodukte in den Lungen von Patienten mit PAH erhöht  7  , und 13 C-α-Ketoglutarat aus 13 C-langkettigen Fettsäuren und Acetyl-CoA-Acetyltransferase 2 (ACAT2) sind in den kultivierten Endothelzellen der Lungenarterie verringert  8  ,  9.  Darüber hinaus tritt eine metabolische Verschiebung von der Glukoseoxidation zur Glykolyse auf, was darauf hindeutet, dass eine verringerte Energieeffizienz ein Mechanismus ist, der dem RV-Versagen in RV-Kardiomyozyten zugrunde liegt  10.  Daher können selektive Inhibitoren der Fettsäureoxidation indirekt die Glukoseoxidation erhöhen und die RV-Funktion verbessern  11  .Trimetazidin (TMZ), ein Inhibitor der langkettigen 3-Ketoacyl-Coenzym A (CoA)-Thiolase, ist an der Beta-Oxidation von Fettsäuren beteiligt und aktiviert indirekt die Glucoseoxidation über den Randle-Zyklus  12  ,  13.  Der Wirkmechanismus von TMZ könnte auf eine Optimierung des Energiestoffwechsels zurückgeführt werden, da TMZ die Fettsäureoxidation verringert und die Glucoseoxidation stimuliert  14.  TMZ verbessert die Energieeffizienz bei RV-Versagen  12  und schwächt den PH bei Ratten mit Monocrotalin-induzierter PAH  15  ab, indem es die mitochondriale Funktion wiederherstellt. Darüber hinaus wurden kürzlich nicht-metabolische Wirkungen von TMZ wie entzündungshemmende  16  , apoptosefördernde und krebshemmende Wirkungen  17  berichtet. Daher führt eine Verringerung der Oxidation langkettiger Fettsäuren mit TMZ zu einer verbesserten Herzleistung in einem Rattenmodell der RV-Hypertrophie und ist eine therapeutische Strategie zur Veränderung metabolischer Wege  12  .Im Su/Hx-Modell erhielten die Tiere eine subkutane Injektion von SU5416, einem Hemmer des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Rezeptors, bevor sie einer Hypoxie ausgesetzt wurden. Su/Hx-Ratten weisen schwere Umbauten der Lungenarterien auf, einschließlich plexiformer Läsionen. Daher gelten Su/Hx-Modelle aufgrund der Bildung okklusiver pulmonaler Gefäßläsionen in der Lunge als wichtige präklinische Modelle für PAH  4  ,  18  . In der vorliegenden Studie führten wir umfassende Analysen des Herzmetaboloms und des Lungentranskriptoms an Ratten mit Su/Hx-induzierter PH durch, um die hemmende Wirkung von TMZ auf die PH-Entwicklung durch die Veränderungen von Biomolekülen wie Metaboliten und Transkripten aufzuklären. Darüber hinaus bestätigten wir die pathophysiologischen Veränderungen in diesem Modell durch die Verabreichung von TMZ.ErgebnisseTMZ hemmt Herzfunktionsstörungen im Su/Hx-induzierten Ratten-PH-ModellWir haben Su/Hx-induzierte PH-Rattenmodelle mit und ohne TMZ-Gabe erstellt (Abb.   1  A). Wir haben die hämodynamischen Parameter mithilfe des Millar Mikro-Tip-Kathetersystems gemessen, um die hemmende Wirkung von TMZ bei der PH-Pathogenese zu bewerten (Ergänzende Tabelle  S1  ). Der rechtsventrikuläre systolische Druck (RVSP) bei den Su/Hx-Ratten war im Vergleich zu dem bei den Kontrollratten (CTRL) erhöht (Abb.   1  . Darüber hinaus verringerte sich nach der TMZ-Gabe das endsystolische Elastizitäts-(Ees)/EA-Verhältnis, ein klinischer Index der funktionellen Kopplung zwischen Ventrikel und Arterie, in der Su/Hx-Gruppe und erholte sich in der CTRL-Gruppe auf ein normales Niveau (Abb.   1  C). Darüber hinaus waren die maximalen (dP/dt max) und minimalen (dP/dt min) RV-Druckraten und die systolischen und diastolischen RV-Leistungsindizes in der Su/Hx-Gruppe erheblich erhöht und durch die TMZ-Behandlung deutlich verringert (Abb.   1  D und E). Es wurden jedoch keine wesentlichen Unterschiede bei der Herzfrequenz (HR), dem Schlagvolumen oder dem Herzindex zwischen den Gruppen CTRL, Su/Hx und Su/Hx + TMZ beobachtet (Abb.   1  F–H).

 Die TMZ-Behandlung verbessert die RV-Hypertrophie und -Umgestaltung im Su/Hx-induzierten PH-RattenmodellDie hemmenden Wirkungen von TMZ auf die durch Su/Hx induzierte RV-Hypertrophie und -Umgestaltung wurden untersucht. Das Verhältnis RV/linker Ventrikel und Septum (LV + S) war in der Su/Hx + TMZ-Gruppe signifikant niedriger als in der Su/Hx-Gruppe (Abb.   2  A). Anschließend wurden RV-Hypertrophie und Fibrose mittels Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H&E) bzw. Massons Trichrom-Färbung ausgewertet (Abb.   2  . Die Größe der RV-Kardiomyozyten und der fibrotischen Bereiche war in der Su/Hx-Gruppe im Vergleich zu denen in der CTRL-Gruppe erhöht und nach der TMZ-Behandlung deutlich gehemmt (Abb.   2  C und D).

 Stoffwechselveränderungen im rechten Herzen der Su/Hx-Ratten nach TMZ-BehandlungVeränderte Stoffwechselwege gelten als die Hauptursachen für die Pathogenese von PAH  5.  Wir haben eine umfassende Stoffwechselanalyse auf Basis der Massenspektrometrie durchgeführt, um die Auswirkungen von TMZ auf Stoffwechselveränderungen in der rechten Herzhälfte von Ratten mit Su/Hx-induzierter PH zu untersuchen. Hauptkomponente 1 (PC1) und PC2 der Metaboliten in den Proben machten 45,1 % bzw. 22,5 % der Gesamtmetaboliten aus (Abb.   3  A). Die biologischen Replikate wurden zwischen den Su/Hx- und TMZ-Gruppen getrennt, wie mithilfe einer hierarchischen Heatmap-Clusteranalyse der Proben beobachtet wurde (Ergänzende Abb.  S1  A). Das Modell der Partial-Least-Squares-Diskriminanzanalyse (PLS-DA) wurde verwendet, um die Unterschiede in den Stoffwechselprofilen zwischen den Su/Hx- und Su/Hx + TMZ-Gruppen zu vergleichen. Der VIP-Score (Variable Importance in Projection) der PLS-DA-Analyse ergab, dass die Werte von Carnitin, Inosinsäure, CoA, Nicotinamidadenindinukleotidphosphat und Glutamin im rechten Herzen der mit TMZ behandelten Su/Hx-Ratten deutlich höher waren als bei den Su/Hx-Ratten (Abb.   3  . Im Gegensatz dazu waren die Werte von Glutathion, Kreatinin, Harnstoff und Aminosäuren wie Prolin, Serin, Asparaginsäure, Tyrosin und Asparagin in der Su/Hx + TMZ-Gruppe deutlich niedriger. Darüber hinaus ergab die Anreicherungsanalyse, dass der Beta-Alanin-Stoffwechsel, der Glycin- und Serin-Stoffwechsel, der Pyruvaldehyd-Abbau, die Fettsäurebiosynthese und der Tryptophan-Stoffwechsel in der SU/Hx mit TMZ-Gruppe niedriger waren als in der Su/Hx-Gruppe (Abb.   3  C). Darüber hinaus waren die Konzentrationen an Brenztraubensäure und Gesamtadenylat (die Summe aus AMP, ADP und ATP) in der Su/Hx + TMZ-Gruppe höher als in der Su/Hx-Gruppe, obwohl der Unterschied statistisch unbedeutend war (Ergänzende Abb.  S1  B–F). Im Gegensatz dazu waren die Konzentrationen an langkettigen Fettsäuren (LCFA) wie Palmitinsäure und Stearinsäure in der Su/Hx + TMZ-Gruppe niedriger als in der Su/Hx-Gruppe (Abb.   3  D und E). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass TMZ die kumulative Energiespeicherung verringert und den Energieabbau erhöht.


 Verbesserung der pulmonalen Gefäßumgestaltung durch TMZ im Su/Hx-induzierten Ratten-PH-ModellWir konzentrierten uns weiter auf die Umgestaltung der Lungengefäße, die mithilfe der Elastica van Gieson (EVG)-Färbung pathologisch quantifiziert wurde. Proben aus der Su/Hx-Gruppe zeigten eine Verdickung der Mittelwand und Läsionen mit kombinierter Mesangial- und Intimaverdickung, die für die Umgestaltung der Lungengefäße charakteristisch sind. Die Verdickung der Mittelwand der kleinen Lungenarterien war in der Su/Hx + TMZ-Gruppe deutlich abgeschwächt (Abb.   4  A). Der Prozentsatz obstruktiver Läsionen zweiten Grades war in der Su/Hx + TMZ-Gruppe deutlich niedriger als in der Su/Hx-Gruppe (Abb.   4  , was darauf hindeutet, dass TMZ die Umgestaltung der Lungenarterien im Su/Hx-induzierten PH-Rattenmodell linderte.


 Die übermäßige Proliferation von glatten Lungenmuskelzellen der Arterie (PASMC) ist ein zellulärer Prozess, der dem Lungengefäßverschluss bei PAH zugrunde liegt. Darüber hinaus spiegeln Hyperproliferation und Apoptoseresistenz von PASMCs einen malignen Phänotyp wider, der an der Umgestaltung der Lungengefäße bei PH beteiligt ist  5.  Interessanterweise zeigten die Ergebnisse der Färbung mit Ki67, einem wichtigen Proliferationsmarker, dass die PASMC-Proliferation durch die TMZ-Behandlung im Su/Hx-induzierten Ratten-PH-Modell signifikant reduziert wurde (Abb.   4C  und D). Um die Wirkung von TMZ auf die Apoptoseresistenz von PASMCs zu bestimmen, bestätigten wir die Apoptoseniveaus von PASMCs durch aktivierte Caspase-3, einen Marker für Zellen in Apoptose. Die Färbung ergab, dass es keinen signifikanten Unterschied zwischen den Su/Hx- und den Su/Hx + TMZ-Gruppen gab (Ergänzende Abb.  S2  ). Anschließend wurden die Zellen unter verschiedenen O2- Bedingungen kultiviert , um den Hypoxiegrad zu bestimmen, der die Zellproliferation in menschlichen (h)PASMCs induziert. Der durch Hypoxie induzierte Tod von hPASMCs trat unter extrem hypoxischen Bedingungen (1 % O2 ) auf. Unterdessen proliferierten hPASMCs, die 10 % O2 ausgesetzt waren, im Vergleich zu denen, die Normoxie (21 % O2) ausgesetzt waren, erheblich ( Abb.   4E  ). Darüber hinaus beeinflussten 100 µM TMZ die Proliferation und Apoptose von hPASMCs unter normoxischen Bedingungen nicht (Ergänzende Abb.  S3  ). Es wurden auch Zellproliferationstests durchgeführt, um die Auswirkungen von TMZ auf die PASMC-Proliferation unter hypoxischen Bedingungen zu beurteilen. TMZ (ca. 0–100 µM) hemmte die hPASMC-Proliferation konzentrationsabhängig unter 10 % O2 - Bedingungen ohne Zytotoxizität, was darauf hindeutet, dass TMZ die Hypoxie-induzierte hPASMC-Proliferation unterdrückte (Abb.   4  F). Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass TMZ die PASMC-Proliferation bei PH unterdrückt.Transkriptomische Veränderungen in der Lunge von Su/Hx-Ratten mit TMZ-BehandlungWir haben eine RNA-Sequenzierung des gesamten Lungengewebes der CTRL-, Su/Hx- und Su/Hx + TMZ-Gruppen durchgeführt, um die molekularen Mechanismen zu verstehen, die den Auswirkungen TMZ-empfindlicher Metaboliten und Transkripte auf die PH-Pathobiologie zugrunde liegen. Eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) wurde durchgeführt, um die Reproduzierbarkeit der biologischen Replikate in den CTRL-, Su/Hx- und Su/Hx + TMZ-Gruppen zu bewerten. Entgegen unseren Erwartungen ergab das PCA-Score-Diagramm keine unterschiedlichen Cluster in den Su/Hx- und Su/Hx + TMZ-Gruppen (Ergänzende Abbildung  S4  ). Die Su/Hx- und Su/Hx + TMZ-Proben unterschieden sich jedoch erheblich von den CTRL-Proben (Abb.   5  A und . Anschließend berechneten wir die Differenz der Reads pro Kilobase pro Million Reads (RPKM) und identifizierten die unterschiedlich exprimierten Gene (DEGs) zwischen den CTRL- und Su/Hx-Gruppen und zwischen den CTRL- und Su/Hx + TMZ-Gruppen unter Verwendung einer Falschentdeckungsrate (FDR) von < 0,05 mit einer Faltungsänderung (FC) ≥ 2 oder ≤ − 2. Hierarchische Clusteranalysen und Vulkandiagramme zeigten, dass 357 (238 hochregulierte und 119 herunterregulierte) und 435 (270 hochregulierte und 165 herunterregulierte) einzigartige Gene in den Su/Hx- und Su/Hx + TMZ-Gruppen im Vergleich zur CTRL-Gruppe signifikant verändert waren (Abb.   5  C–F und ergänzende Tabelle  S2  ).


 Identifizierung der Kandidaten-Zielgene von TMZ zur PH-VerbesserungWir verglichen die DEGs zwischen den Gruppen Su/Hx und Su/Hx + TMZ, um die Kandidaten-Zielgene von TMZ bei der pulmonalen Gefäßumgestaltung zu bestimmen. Wir identifizierten 58 DEGs, die in der Gruppe Su/Hx vs. CTRL hochregulierte Expressionsniveaus zeigten, aber nicht in der Gruppe Su/Hx + TMZ vs. CTRL (Abb.   6  A und Zusatztabelle  S3  ). Diese DEGs könnten einen Abwehrmechanismus darstellen, der bei der Entwicklung von PH durch TMZ beeinflusst wird. Wir führten eine Anreicherungsanalyse des Gensatzes für die Genontologie-Annotation (GO) und eine Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)-Pfadanalyse durch, um die funktionellen Merkmale dieser 58 DEGs zu charakterisieren. Bezüglich des biologischen Prozesses wurden die GO-Anmerkungen „Keratinozytenproliferation“, „Positive Regulierung der apoptotischen Zellclearance“, „Regulierung der apoptotischen Zellclearance“, „Tetrahydrobiopterin-Stoffwechselprozess“, „Positive Regulierung von Kalzium-vermittelten Signalen“, „Pteridin-haltiger Verbindungsstoffwechselprozess“, „Makrophagen-Chemotaxis“ und „Makrophagenmigration und Stickstoffmonoxid-(NO)-Biosyntheseprozess“ aufgeführt (Abb.   6  , was nahelegt, dass TMZ Genfunktionen abschwächt, die mit diesen GO-Begriffen bei der PH-Entwicklung in Zusammenhang stehen. Zusätzlich ergab die KEGG-Signalweganalyse die GO-Begriffe, die am Entzündungsstress beteiligt sind, wie z. B. fortgeschrittene „Glykationsendprodukte (AGEs)/Rezeptor für fortgeschrittene Glykationsendprodukte (RAGE)-Signalweg“, „Sphingolipid-Signalweg“ und „Arginin-Biosynthese“. Darüber hinaus deutete die Cluster-Gramm-Analyse darauf hin, dass in biologischen Prozessen von GO das CC-Motiv-Chemokin 2 (CCL2 ) (Monozyten-Chemoattraktant-Protein 1; MCP1), Komplement C4B (C4B), CKLF, CCL21, C-Typ-Lektin-Domäne-enthaltendes 7A (CLEC7A), CDH13, FERMT1, NO-Synthase 3 (NOS3, eNOS) und GTP-Cyclohydrolase 1 (GCH1) durch die TMZ-Behandlung unterdrückt wurden (Ergänzende Abb.  S5  A). Die TMZ-Behandlung unterdrückte IL-6, CCL2 , CCL21, PLCB2, NOS3, FCER1A, C4B, C1S, EGR2, CLEC7A, GTP-Cyclohydrolase (GCH) und Aldo-Keto-Reduktase-Familie-1-Mitglied B10 (AKR1B10) in der KEGG-Signalweganalyse (Ergänzende Abb.  S5  .


 Unter den Transkripten waren 119 DEGs in der Su/Hx-Gruppe im Vergleich zu denen in der CTRL-Gruppe herunterreguliert; davon waren die Expressionsniveaus der 48 Transkripte in der Su/Hx + TMZ vs. CTRL-Gruppe nicht herunterreguliert (Abb.   6  C). Diese DEGs könnten einen Teil darstellen, der während der PH-Entwicklung durch TMZ wiederhergestellt wurde. In Bezug auf den biologischen Prozess wurden Begriffe wie „Regulierung des systemischen arteriellen Blutdrucks durch Endothelin“ und „tonische Kontraktion der glatten Muskulatur“ aufgeführt (Abb.   6  D). Unterdessen ergab die KEGG-Signalweganalyse Begriffe wie „Insulinsekretion“, „Kontraktion der vaskulären glatten Muskulatur“ und „Arginin- und Prolinstoffwechsel“.Auswirkungen von TMZ auf die mit dem Energiestoffwechsel verbundene Genexpression in der Lunge von Su/Hx-induzierten PH-RattenAbschließend führten wir eine quantitative Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) an den gesamten Lungen aus jeder Versuchsgruppe durch, um die Wirkung von TMZ auf den Energiestoffwechsel in der Lunge zu untersuchen. Die mRNA-Werte von Fettsäuretransportern, einschließlich Cd36 , Cpt1a und Cpt2 , waren in der Su/Hx-Gruppe im Vergleich zu denen in der CTRL-Gruppe erhöht und durch die TMZ-Behandlung erheblich reduziert, was darauf hindeutet, dass TMZ den durch Su/Hx induzierten pulmonalen Fettsäurestoffwechsel herunterreguliert (Abb.   7  A–C).


 Die Neuprogrammierung des Energiestoffwechsels mit bevorzugter Nutzung der aeroben Glykolyse spielt bei der Entwicklung von PH eine entscheidende Rolle  19.  Die mRNA-Werte der Glykolyseenzyme, einschließlich Glut1 , Glut4 , Hk1 , Hk2 , Pfkm und Pdk1 , 2 , 4, waren in der Su/Hx-Gruppe erheblich höher als in der CTRL-Gruppe (Abb.   7  D–K). Interessanterweise war die Expression dieser acht Gene in der Su/Hx + TMZ-Gruppe deutlich geringer als in der Su/Hx-Gruppe. Zusammengefasst deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass TMZ direkt auf die Lunge einwirkt, um eine Neuprogrammierung des Energiestoffwechsels mithilfe der aeroben Glykolyse während der Entwicklung von PH zu vermeiden.DiskussionPatienten mit PH weisen deutliche Beeinträchtigungen der pulmonalen Hämodynamik und der Gefäßwachstumsregulierung auf  20  . Außerdem wurden Stoffwechselstörungen im Herzen und in der Lunge von Patienten, in Tiermodellen der Krankheit und in aus der Lunge von Patienten mit PH gewonnenen Zellen festgestellt  3  ,  4  ,  5  . Deshalb sind Energiestoffwechselwege teilweise potentielle therapeutische Ziele für PH. TMZ wird häufig als antiischämisches Mittel zur klinischen Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen eingesetzt, darunter Angina Pectoris, Ischämie-Reperfusion, diabetische Kardiomyopathie und Herzinsuffizienz  20  . Durch Hemmung der mitochondrialen langkettigen 3-Ketoacyl-Coenzym-A-Thiolase verlagert TMZ den Energiestoffwechsel des Herzens von der Fettsäureoxidation zur Glukoseoxidation  12  ,  13  .Hier haben wir die hemmende Wirkung von TMZ auf die PH-Entwicklung bei Ratten mit Su/Hx-induzierter PH mithilfe einer Kombination aus pathologischer Analyse und Biomolekülprofilierung untersucht. Die hämodynamische Analyse ergab, dass die Verabreichung von TMZ den RVSP verringerte und Ees/Ea, das Verhältnis von ventrikulärer zu vaskulärer Elastizität, wiederherstellte, was darauf hindeutet, dass TMZ den PH-Grad und die übermäßige Belastung der Funktion des rechten Herzens im Su/Hx-induzierten PH-Modell linderte. Darüber hinaus haben wir bestätigt, dass die TMZ-Behandlung die Verdickung der medialen Wand rückgängig machte, das Verhältnis okklusiver Läsionen in den kleinen Lungenarterien verringerte und die Größe der RV-Kardiomyozyten und den Grad der RV-Freiwandfibrose reduzierte.Eine Analyse des kardialen Metaboloms bei Ratten mit Su/Hx-induzierter PH ergab, dass die Gesamtadenylatkonzentration in der mit TMZ behandelten Gruppe tendenziell höher war (Ergänzende Tabelle  S4  ). Außerdem linderte die Gabe von TMZ die Hypertrophie des rechten Herzens teilweise durch die Beseitigung anhaltender Drucküberlastung und Verbesserung der Energieeffizienz. Dies wurde durch den Anstieg von Ees/Ea im Su/Hx-Rattenmodell nachgewiesen, da Ees/Ea Aufschluss über die Energiebilanz des Myokards gibt. Daher könnte die Verbesserung der Herzfunktion ein Sekundäreffekt der Verringerung der Drucküberlastung sein, obwohl die schützende Wirkung von TMZ auf das Myokard teilweise zur Energieoptimierung beitragen könnte. Interessanterweise wurde berichtet, dass eine RV-spezifische Ansammlung von LCFA zu Lipotoxizität führen kann  21.  Die verbesserte RV-Hypertrophie könnte auch sekundär auf eine Umgestaltung der Lungengefäße zurückzuführen sein, und TMZ könnte eine metabolisch modulierende Wirkung auf die Lungengefäße haben. Insbesondere im Hinblick auf die mitochondriale und metabolische Neuprogrammierung im rechten Herzen zeigte die metabolomische Analyse, dass TMZ die LCFA-Konzentration, insbesondere Palmitin- und Stearinsäure, reduzierte. Daher deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass sich die Energiebilanz des RV-Myokards im verbesserten Zustand von PH nach der TMZ-Gabe erholte.Die TMZ-Behandlung schwächte den pulmonalvaskulären Umbau bei den Su/Hx-induzierten PH-Ratten ab (Abb.   4  ). Die PASMC-Proliferation ist eine wichtige pathophysiologische Komponente des vaskulären Umbaus bei PAH  22.  Neben einer erhöhten Proliferation weisen pulmonalvaskuläre Zellen bei PH eine Apoptoseresistenz auf, die auch als wichtige pathologische Komponente des pulmonalvaskulären Umbaus gilt  23.  Bemerkenswerterweise hemmte die TMZ-Behandlung die PASMC-Proliferation bei den Su/Hx-induzierten PH-Ratten deutlich. Im Gegensatz dazu hatte TMZ keinen Einfluss auf die Apoptoseresistenz von PASMC im Su/Hx-induzierten PH-Rattenmodell (Ergänzende Abb.  S2  ). Es ist bekannt, dass der Knockdown des mammalian Target of Rapamycin (mTOR) mittels siRNA die Proliferation von Hypoxie-induzierten PASMCs deutlich hemmt  24  . Der mTOR-Signalweg wird in den Lungen von Ratten mit Su/Hx-induzierter PH aktiviert  25  ,  26  . Wie in Bezug auf den biologischen Prozess in Abb.   6  B gezeigt, waren die hochregulierten 58 DEGs zwischen der Su/Hx- vs. CTRL-Gruppe mit „positiver Regulierung der AMPA-Rezeptoraktivität (GO:2000969)“ angereichert. Darüber hinaus ist TMZ mit einer Abnahme der Aktivierung des AMP-aktivierten Proteinkinase (AMPK)/mTOR-Signalwegs verbunden  26  , was unsere Ergebnisse unterstützt.Über die entzündungshemmende und krebshemmende Wirkung von TMZ wurde bereits früher berichtet  16  ,  17.  Analysen von menschlichen Proben und PH-Nagetiermodellen haben eindeutig eine Infiltration verschiedener Immunzellen, einschließlich Monozyten, in die perivaskulären Regionen der Lunge und deren Beteiligung an der Entwicklung von PH gezeigt. Gleichzeitig weist das Lungengewebe eine erhöhte Expression von Chemokin-Transkripten auf, einschließlich derjenigen, die für die Rekrutierung von Monozyten verantwortlich sind, wie z. B. CCL2. Unsere pulmonale Transkriptomanalyse hat gezeigt, dass das Gen Ccl2 (Mcp1) eines der 58 DEGs in der Anreicherung biologischer Prozesse von GO und in den KEGG-Signalwegen ist, die vermutlich durch eine TMZ-Behandlung während der Entwicklung von PH unterdrückt werden (Ergänzende Abb.  S3  A, . CCL2, das in pulmonalen Endothelzellen überexprimiert wird, fungiert Berichten zufolge bei Patienten mit PH als Wachstumsfaktor für PASMC  27  ,  28  . Darüber hinaus bestätigten wir, dass die Ccl2 -mRNA -Werte in den Lungen von Ratten mit Su/Hx-induzierter PH höher waren als in den Kontrollgruppen und in der mit TMZ behandelten Gruppe tendenziell niedriger waren (Ergänzende Abbildung  S3  C). Dies deutet darauf hin, dass TMZ CCL2-vermittelte Entzündungsprozesse über Makrophagen-Chemotaxis und -Migration während der PH-Pathogenese unterdrückt.Im Gegensatz dazu ist Stickoxid-Synthase 3 (NOS3 und eNOS) im Gefäßendothel reichlich vorhanden und produziert Stickoxid (NO) aus L-Arginin und dem Coenzym Tetrahydrobiopterin, einem wichtigen Molekül, das an der Pathogenese von PAH beteiligt ist  29.  Darüber hinaus waren niedrige NO-Produktionsniveaus bei Patienten mit PAH und Su/Hx-Ratten auf eine Entkopplung von NOS3 mit Induktion von Arginase 1 zurückzuführen, was zu einer übermäßigen ROS-Produktion führte  30  ,  31.  Es wurde konsistent gezeigt, dass TMZ kardioprotektive Wirkungen auf die koronare Mikrozirkulation durch NO-abhängige Effekte hat, bei denen die eNOS-mRNA- und Proteinniveaus ansteigen  32  ,  33.  Insbesondere waren die mRNA-Expressionsniveaus von Nos3 -mRNA im Lungengewebe der Su/Hx-Gruppe erhöht und wurden durch die TMZ-Behandlung verringert (Ergänzende Abb.  S3  D). Darüber hinaus war das Nos3-Gen mit den biologischen Prozessbegriffen der Clustergrammanalyse angereichert, wie „Tetrahydrobiopterin-Stoffwechselprozess“, „Pteridin-Verbindungs-Stoffwechselprozess“ und „Stickstoffmonoxid-Biosyntheseprozess“ (Ergänzende Abb.  S3  A). Daher kann die Erhöhung von Nos3 in der Su/Hx-Gruppe die geringe NO-Produktion kompensieren, die in der Su/Hx + TMZ-Gruppe wiederhergestellt wurde. Im Gegensatz dazu deutete eine vorherige Studie darauf hin, dass die NOS3-Phosphorylierungsniveaus und die NO-Produktion in den Lungenzellen hypoxieinduzierter Tiere abnahmen, was einer Abnahme der AMPK-Aktivität entspricht  34  ,  35.  Wir identifizierten 58 Kandidaten-Zielgene von TMZ in der PH-Entwicklung, die im Hinblick auf die „positive Regulierung der AMPK-Rezeptoraktivität (GO:2000969)“ angereichert waren (biologische Prozessbegriffe von Abb.   6  . Durch die Aktivierung von AMPK werden NOSs aktiviert, was allgemein als einer der wichtigsten Regulationsmechanismen der NOS3-Aktivität und der anschließenden Vasodilatation anerkannt ist  36  , was unsere Studie unterstützt.Einer der Mechanismen der RV-Dysfunktion bei PAH ist ein maladaptiver Fettsäurestoffwechsel, der auf eine erhöhte Fettsäureaufnahme durch seine Transportermoleküle wie CD36, CPT1 und CPT2 und ein Ungleichgewicht zwischen Glukose und Fettsäureoxidation in den Mitochondrien zurückzuführen ist. Diese Dysfunktionen führen zu einer Lipidansammlung in Form von Triglyceriden, Diacylglycerol und Ceramiden im Zytoplasma, was für Lipotoxizität charakteristisch ist  37.  In der vorliegenden Studie haben wir gezeigt, dass die mRNA-Spiegel von Fettsäuretransportern einschließlich Cd36 , Cpt1a und Cpt2 durch die Verabreichung von TMZ in die Lungen von Su/Hx PH-Ratten herunterreguliert wurden. Dies legt nahe, dass TMZ direkt in den Lungen wirkt, um eine Neuprogrammierung des Energiestoffwechsels mittels aerober Glykolyse während der PH-Entwicklung zu vermeiden. Interessanterweise waren die mRNA-Werte von glykolytischen Enzymen, einschließlich Glut1 , Glut4 , Hk1 , Hk2 , Pfkm und Pdk1 , 2 , 4 , in den Lungen von Su/Hx PH-Ratten erhöht; die TMZ-Behandlung verringerte jedoch die Aktivität dieser glykolytischen Enzyme. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass TMZ die Fettsäureoxidation verringert und die Glukoseoxidation fördert und so das metabolische Ungleichgewicht bei der PH-Pathogenese korrigiert.TMZ wird häufig zur Behandlung koronarer Herzkrankheiten eingesetzt und es liegen umfangreiche Informationen zu seiner Verträglichkeit und Sicherheit vor  38  ,  39  ,  40.  Seine klinische Anwendung bei PH ist eine potenzielle Behandlungsoption, obwohl weitere Studien erforderlich sind. Zusammengefasst können unsere Profile veränderter Biomoleküle, einschließlich Herzmetaboliten und pulmonaler Transkripte, mit TMZ bei den Su/Hx-induzierten PH-Ratten mit oder ohne TMZ-Behandlung vielversprechende Informationen zum Verständnis der therapeutischen Ziele bei PH liefern.