Transkriptomisches Profiling zeigt Zellproliferation im Verlauf ...

Transkriptomisches Profiling zeigt Zellproliferation im Verlauf experimenteller pulmonaler Hypertonie bei Ratten
www.nature.com/articles/s41598-024-64251-w
AbstraktPulmonale arterielle Hypertonie (PAH) ist eine fortschreitende Erkrankung, die durch Umformung und Verschluss der Lungengefäße gekennzeichnet ist und unbehandelt zu erhöhtem Lungenarteriendruck, Hypertrophie des rechten Ventrikels und schließlich zu Herzversagen führt. Das Verständnis der molekularen Mechanismen, die der Entwicklung und dem Fortschreiten der pulmonalen Hypertonie (PH) zugrunde liegen, ist entscheidend für die Entwicklung effizienter therapeutischer Ansätze für die Krankheit. Lungenhomogenate wurden wöchentlich gesammelt und im Rattenmodell mit Monocrotalin (MCT)-induzierter PH einer RNA-Sequenzierung unterzogen, um Gene zu erforschen, die mit dem Fortschreiten der PH in Zusammenhang stehen. Statistische Analysen ergaben 1038, 1244 und 3125 signifikant veränderte Gene (P < 0,05, abs (log 2 -fache Veränderung) > log 2 1,5) zwischen Kontrollratten und MCT-exponierten Ratten während der ersten, zweiten und dritten Woche. Pathway-Anreicherungsanalysen zeigten eine Beteiligung des Zellzyklus und des angeborenen Immunsystems bei den hochregulierten Genen, GPCR- und VEGF-Signalisierung bei den herunterregulierten Genen. Darüber hinaus bestätigte qRT-PCR die Hochregulierung repräsentativer Gene, die mit dem Zellzyklus in Zusammenhang stehen, darunter Cdc25c (Zellteilungszyklus 25C), Cdc45, Top2a (Topoisomerase IIα), Ccna2 (Cyclin A2) und Ccnb1 (Cyclin B1). Western Blot- und Immunfluoreszenzanalysen bestätigten erhöhte Werte von PCNA, Ccna2, Top2a sowie anderen Proliferationsmarkern im Lungengewebe von mit MCT behandelten Ratten. Zusammenfassend unterstreichen die RNA-Sequenzierungsdaten die Bedeutung der Zellproliferation für das Fortschreiten der PH bei Nagetieren.


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 DiskussionMit der Entwicklung von PH geht eine komplexe Dysregulation zahlreicher Proteine ​​und Signalwege einher, was die Entwicklung therapeutischer Ansätze vor Herausforderungen stellt. Die Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung bietet eine unvoreingenommene und leistungsstarke Methode, um die unterschiedlich exprimierten Gene, die mit der Entwicklung von PH in Zusammenhang stehen, systematisch zu screenen und hilft, die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen dieser Krankheit zu verstehen. Mit MCT behandelte Ratten und Hypoxie-Sugen-Ratten sind zwei der beliebtesten Rattenmodelle für PH. Diese beiden Modelle haben viele Gemeinsamkeiten bei der Nachahmung der pathologischen Merkmale von PAH-Patienten, wie z. B. Umformung der Lungengefäße, erhöhter RVSP und Funktionsstörung des rechten Ventrikels  20  . Das Hypoxie-Sugen-Modell ist ein leistungsfähiges Translationsmodell, wird jedoch teilweise durch die Heterogenität seiner Verwendung durch die Forscher eingeschränkt, einschließlich der Verabreichung unterschiedlicher Sugen-Dosen, die mit erheblich unterschiedlichen Zeitplänen (5–11 Wochen) verbunden sind. Darüber hinaus mangelt es aufgrund der geringen Löslichkeit von Sugen und der Notwendigkeit einer subkutanen Injektion an Harmonisierung zwischen den Laboren. Im Gegensatz dazu ist MCT in wässriger Pufferlösung gut löslich, praktischer und wurde größtenteils als 3–4-Wochen-Modell publiziert. In dieser Studie wurde RNA-Seq an den Lungengeweben von Ratten angewendet, die ein bis drei Wochen lang mit MCT oder PBS behandelt wurden, mit dem Ziel, Gene zu identifizieren, die sich in verschiedenen Stadien der PH-Progression verändern. Die statistische Analyse ergab in jeder Woche 658, 520 und 1502 herunterregulierte Gene sowie 380, 724 und 1623 hochregulierte Gene. Unter diesen differentiell exprimierten Genen (DEGs) wurden 124 häufig hochregulierte Gene und 110 häufig herunterregulierte Gene identifiziert, von denen viele bereits zuvor eine Beteiligung an PH nachgewiesen haben, wie z. B. Thbs1  21  , CDK1  22  , Foxm1  23  , Ccl2  24  , Nlrp3  25  und Kpna2  26  , was die Verlässlichkeit der aktuellen RNA-Seq-Analyse weiter untermauert. Darüber hinaus zeigte sich in den Wochen 2 und 3 eine Hochregulierung eines signifikant veränderten Gens, Cpa3 (Mastzell-Carboxypeptidase A), das kürzlich mit chronisch obstruktiver Lungenerkrankung und idiopathischer Lungenfibrose  27  in Zusammenhang gebracht wurde , was auf seine mögliche Rolle bei PH hindeutet.Pathway-Anreicherungsanalysen für diese DEGs ergaben, dass in Woche 1 hochregulierte Gene stark in zellzyklus- und proliferationsbezogenen Pathways angereichert waren. Zellzyklus-Pathway ist auch ein stark angereicherter Begriff für in Woche 2 hochregulierte Gene. Die Bestätigung durch qRT-PCR zeigte eine erhöhte Expression von Genen, die an Zellzyklusprogression und Proliferation in den Lungen von mit MCT behandelten Ratten beteiligt sind. Darüber hinaus bestätigte Western Blotting die Hochregulierung der Zellproliferationsmarker PCNA und Ccna2 in den Lungengeweben von mit MCT behandelten Ratten. Immunfluoreszenz bestätigte die Hochregulierung von PCNA und Ki67, weiteren Zellproliferationsmarkern. Ein faszinierender Befund war die Hochregulierung von Top2a im Frühstadium, einem neuen und wenig erforschten potenziellen Ziel für PAH. Als wichtiges Mitglied der Topoisomerase-Proteinfamilie spielt Top2a eine entscheidende Rolle bei der DNA-Replikation und Zellproliferation und ist bei verschiedenen Krebsarten hochreguliert  28  , was auf seinen möglichen Beitrag zur Entwicklung und zum Fortschreiten der PH hindeutet.Die aktuellen Erkenntnisse deuten auch darauf hin, dass im Frühstadium der Erkrankung und beim Fortschreiten von PH eine verstärkte Zellproliferation erkennbar ist. Ratten, die zwei oder drei Wochen lang mit MCT behandelt wurden, wiesen einen deutlich höheren RVSP auf als Kontrollratten, was auf ein schnelles Fortschreiten der Erkrankung hindeutet. Interessanterweise begannen diese Zellzyklusmarker ihre Expression später im Krankheitsverlauf herunterzuregulieren, was darauf hindeuten könnte, dass die Zellproliferation im molekularen Mechanismus der Erkrankung möglicherweise keine Priorität hat, wenn die Umgestaltung erst einmal mittelschwer bis schwerwiegend ist. In Woche 2 und 3 hochregulierte Gene waren in häufigen PH-bezogenen Signalwegen angereichert, wie etwa im angeborenen Immunsystem, der Hämostase  29  und der extrazellulären Matrixorganisation (ECM)  30.  Außerdem waren herunterregulierte Gene bei MCT-Ratten in mit PH verbundenen Signalwegen angereichert, darunter die Signalgebung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs)  31  , die Signalgebung des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF)  32  und der Kollagenabbau, was auf eine mögliche Rolle der ECM-Umgestaltung während des Fortschreitens von PH hindeutet.Die im Lungengewebe von MCT-Ratten identifizierten differentiell exprimierten Gene wurden dann mit den Ergebnissen eines veröffentlichten Gen-Array-Datensatzes verglichen, der von PAH-Patienten erstellt wurde. Dabei zeigte sich, dass die Überschneidung zwischen dieser Studie und dem Datensatz zwischen 10 % und 20 % lag. Diese Beobachtung könnte teilweise auf die unterschiedlichen Spezies und die Beschränkungen des Tiermodells zurückzuführen sein. Das MCT-Modell beispielsweise wird mit Toxizität in mehreren Organen, insbesondere der Leber, in Verbindung gebracht, was bei Patienten nicht der Fall ist  33  . Um die Assoziation der Top-Gene aus dem MCT-Modell zu bestätigen, legen unsere Daten daher nahe, dass entweder eine zusätzliche Modellbewertung oder klinische Proben erforderlich sind.Zusammenfassend beschreibt diese Studie umfassend Genveränderungen, die mit dem Fortschreiten der PH in Zusammenhang stehen, unter Verwendung von RNA-Sequenzierung in MCT-induzierten Rattenmodellen. Die Analyse der Signalweganreicherung hat potenzielle Signalwege aufgezeigt, die an der Krankheitsentwicklung beteiligt sind. Die Validierung durch qRT-PCR, Western Blotting und Immunfluoreszenzfärbung stärkt den Zusammenhang zwischen der erhöhten Expression von Genen, die mit der Zellproliferation im Lungengewebe in Zusammenhang stehen, und dem Fortschreiten der PH. Diese Arbeit dient als vorläufige Untersuchung und erfordert weitere eingehende Untersuchungen auf diesem Gebiet.Materialen und MethodenAlle Experimente wurden gemäß den relevanten Richtlinien und Vorschriften der Northwest A&F University und des First Affiliated Hospital der Guangzhou Medical University durchgeführt.