Autophagie und Ubiquitin-abhängige Proteolyseprozesse bei linksventrikulärem...

Autophagie und Ubiquitin-abhängige Proteolyseprozesse bei linksventrikulärem Masseverlust bei pulmonaler arterieller Hypertonie


www.nature.com/articles/s41598-024-64950-4
AbstraktDas Ziel dieser Studie war, die Intensität der Autophagie und der ubiquitinabhängigen Proteolyseprozesse zu bewerten, die im Myokard des linken Ventrikels (LV) in späteren Stadien der pulmonalen arteriellen Hypertonie (PAH) auftreten, um die Mechanismen zu bestimmen, die für den LV-Massenverlust in einem durch Monocrotalin induzierten PAH-Rattenmodell verantwortlich sind. Von 32 Wistar-Ratten gesammelte LV-Myokardproben wurden in eine frühe PAH-Gruppe (n = , zeitpaarweise Kontrollgruppen (n = , eine PAH-Gruppe im Endstadium (n = und deren Kontrollgruppen (n = analysiert. Die Proben wurden histologischen Analysen mit Immunfluoreszenzfärbung, einer Autophagiebewertung durch Western Blotting und einer Bewertung der ubiquitinabhängigen Proteolyse im LV durch Immunpräzipitation ubiquitinierter Proteine ​​unterzogen. Echokardiografische, hämodynamische und herzmorphometrische Parameter wurden während des gesamten Experiments regelmäßig bewertet. Im Verlauf der PAH wurden erhebliche morphologische und hämodynamische Umgestaltungen des LV beobachtet. Das Endstadium der PAH war mit einer deutlich beeinträchtigten systolischen LV-Funktion und einer Abnahme der LV-Masse verbunden. Der LC3B-II-Ausdruck im LV war in der Gruppe mit PAH im Endstadium signifikant höher als in der Gruppe mit PAH im Frühstadium ( p  = 0,040). Die gemessenen LC3B-II/LC3B-I-Verhältnisse in der Gruppe mit PAH im Endstadium waren im Vergleich zu den Kontrollgruppen signifikant erhöht ( p  = 0,039). Die Immunfluoreszenzfärbung zeigte eine signifikante Zunahme der Häufigkeit von LC3-Puncta in der Gruppe mit PAH im Endstadium im Vergleich zu den entsprechenden Kontrollgruppen. Es gab keine statistisch signifikanten Unterschiede in den Expressionsniveaus aller ubiquitinierten Proteine ​​beim Vergleich der PAH-Gruppen und der entsprechenden Kontrollgruppen. Autophagie kann als der Mechanismus hinter dem LV-Massenverlust im Endstadium der PAH angesehen werden.Ähnliche Inhalte werden von anderen angesehen Myokardproteomisches Profil bei pulmonaler arterieller Hypertonie Artikel Offener Zugang01. September 2020 Rechtsventrikuläres versus linksventrikuläres Remodeling bei Herzinsuffizienz aufgrund chronischer Volumenüberlastung Artikel Offener Zugang24. August 2021 Chronische Drucküberlastung führt zu einem Mangel des mitochondrialen Membrantransporters ABCB7, was zu Eisenüberlastung, mitochondrialen Funktionsstörungen, Stoffwechselverschiebung und einer Verschlechterung der Herzfunktion beiträgt Artikel Offener Zugang11. September 2019EinführungPulmonale arterielle Hypertonie (PAH) ist eine seltene, chronische und lebensbedrohliche Erkrankung, die durch einen fortschreitenden Anstieg des pulmonalen Gefäßwiderstands gekennzeichnet ist, der zu Herzversagen führt  1  . Die jährliche Inzidenz von PAH beträgt etwa 2–7 Neuerkrankungen pro Million Erwachsene  2  ,  3  ,  4  . Die Anzeichen und Symptome von PAH entwickeln sich langsam und sind untypisch  5  . Obwohl eine frühe Diagnose und sofortige Behandlung schwierig sind, sind sie wichtig für die Kontrolle von PAH und die Verbesserung der Lebensqualität der Patienten  6  .Die Entwicklung einer rechtsventrikulären und später einer linksventrikulären Herzinsuffizienz als Folge einer PAH ist ein starker negativer prädiktiver Faktor. Es werden mehrere morphologische Veränderungen des Herzens als Folge eines chronisch erhöhten Blutdrucks im Lungengefäßsystem beobachtet  7  . Kenntnisse über die Abfolge der morphologischen Veränderungen des Herzens während der Entwicklung einer PAH können uns helfen, PAH-Patienten mit hohem Risiko zu identifizieren und Entscheidungen über gezielte PAH-Therapien zu treffen.Eine Hypertrophie des rechten Ventrikels tritt als Anpassungsreaktion auf eine erhöhte Nachlast des rechten Ventrikels auf  8  ,  9.  Mit Fortschreiten der PAH brechen die Kompensationsfaktoren zusammen und es kommt zum Versagen des rechten Ventrikels infolge Drucküberlastung  7  ,  8.  Das funktionelle und morphologische Versagen des rechten Ventrikels entwickelt sich fortschreitend ab dem Primärstadium der PAH, eine Umgestaltung des linken Ventrikels kommt es im Endstadium der PAH  7  ,  10  ,  11.  In den Endstadien der Erkrankung kommt es zu einer Abnahme der Masse und Wanddicke des linken Ventrikels sowie zu einer Striktur seiner Höhle  7  ,  11.  Darüber hinaus kommt es zu einer allmählichen Abnahme des systolischen Drucks im linken Ventrikel  7  ,  12  .In den letzten Jahren wurden erhebliche Fortschritte im Verständnis der zugrunde liegenden Pathomechanismen der PAH erzielt, einschließlich der molekularen Prozesse, die der Umgestaltung des Herzens im Verlauf zugrunde liegen  7  ,  13  ,  14.  Obwohl die Mechanismen der Umgestaltung und des Versagens des rechten Ventrikels große Aufmerksamkeit unter Forschern erregen, sind die Grundlagen des Masseverlusts und der Funktionsstörung des linken Ventrikels noch immer unvollständig  15  ,  16.  In unserer jüngsten Shotgun-Proteomstudie wurden mehrere signifikante Veränderungen im linken Ventrikel identifiziert, die mit der durch PAH verursachten Linksventrikelinsuffizienz in Verbindung stehen könnten. So wurde zum Beispiel eine erhöhte Aktivität des apoptotischen Signalwegs entdeckt  17  .Autophagie ist ein Prozess, der eine bedeutende Rolle beim Abbau von Kardiomyozyten als Reaktion auf hämodynamischen Stress spielt  18  . Somit kann auch bei PAH eine Beteiligung der Autophagie an den Prozessen der myokardialen Reaktion auf Bedingungen hämodynamischer Belastung vorliegen. Zwischen den beiden synergistischen Abbausystemen Autophagie und Ubiquitin-abhängiger Proteolyse kommt es zu gegenseitigen Interaktionen, sodass sich die beiden Mechanismen möglicherweise synergistisch ergänzen, um die zelluläre Homöostase des Herzens aufrechtzuerhalten  19  . Daher bestand das Ziel dieser Studie darin, die Intensität der Autophagie- und Ubiquitin-abhängigen Proteolyseprozesse im Myokard des linken Ventrikels in nachfolgenden Stadien der PAH zu bewerten, um die Mechanismen zu bestimmen, die für den Masseverlust des linken Ventrikels verantwortlich sind.Material und MethodenTiermodell und VersuchsaufbauDiese Studie ist Teil des vom Nationalen Wissenschaftszentrum Polen geförderten Projekts „Autophagie und Ubiquitin-Proteasom-System als mögliche Mechanismen, die für den Massenverlust des linken Ventrikels in einem Rattenmodell mit monocrotaliner pulmonaler Hypertonie verantwortlich sind“ (2016/23/N/NZ5/00597). Das in dieser Studie entwickelte Tiermodell wurde auch für andere Analysen verwendet  7  ,  17  . Die Studie wurde gemäß den Richtlinien der Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere durchgeführt und vom 2. Lokalen Ethikkomitee in Krakau, Polen (Nr. 60/2016) genehmigt. Die Studie wird gemäß den ARRIVE-Richtlinien berichtet. Insgesamt 66 männliche Wistar-Ratten (8 Wochen alt; zur Verfügung gestellt vom Zentrum für Experimentalmedizin der Medizinischen Universität Bialystok, Polen) wurden zufällig zwei Gruppen zugeteilt. In der Untersuchungsgruppe wurde 48 Ratten zur Induktion von PAH 20 eine Einzeldosis von 60 mg/kg Körpergewicht Monocrotalin in Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (3 ml/kg Körpergewicht, Sigma-Aldrich, Deutschland) intraperitoneal injiziert  .  In der Kontrollgruppe wurde Tieren (n = 18) das Medium Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (3 ml/kg Körpergewicht, Sigma-Aldrich, Deutschland) ohne Monocrotalin injiziert.Die Ratten wurden unter Standardbedingungen gehalten und mit normalem Rattenfutter gefüttert. Sie wurden regelmäßig transthorakalen Echokardiogramm-Untersuchungen (TTE) unterzogen (Mindray M7 mit P12-4s, 4,2–11 MHz-Wandler, Mindray Bio-Medical Electronics Co., Shenzhen, China), wie zuvor beschrieben (Ergänzende Abb.   1  )  7.  Das TTE wurde an einem wachen Tier (ohne Verabreichung von Medikamenten) durchgeführt, das am Tag 0 (vor der intraperitonealen Injektion) und an den Tagen +5, +10, +15, +20, +24 und dann alle drei Tage sowie am Tag der Euthanasie des Tiers manuell in liegender Position auf dem Rücken immobilisiert wurde. Der erste Endpunkt dieser Studie war (1) PAH im Frühstadium, gekennzeichnet durch erste morphologische Läsionen des rechten Ventrikels, die auf dem TTE von Ratten sichtbar waren (enddiastolische freie Wanddicke des rechten Ventrikels > 0,7 mm)  7  ,  21.  Insgesamt 12 Tiere aus der Studiengruppe, die dieses Kriterium erfüllten, und acht zeitpaarige Ratten aus der Kontrollgruppe wurden getötet. Der zweite Endpunkt war (2) PAH im Endstadium (Herzinsuffizienz als Folge von PAH), gekennzeichnet durch klinische Anzeichen einer Rechtsventrikelinsuffizienz bis hin zum Kreislauf- und Atemversagen im Endstadium, darunter: (1) Dyspnoe, definiert als gesteigerte Atemanstrengung und abwechselnde Atembewegungen von Brust und Abdomen der Ratte, (2) verringerte Temperatur in der unteren Körperhälfte, den Extremitäten und dem Schwanz, subjektiv bei körperlicher Untersuchung beurteilt (3), zyanotische Augen (4), deutlich verringerte körperliche Aktivität, Lethargie. Insgesamt wurden 18 Tiere mit Herzversagen im Endstadium und acht zeitgepaarte Ratten aus der Kontrollgruppe getötet. Die übrigen Ratten (n = 18) aus der mit Monocrotalin injizierten Gruppe (n = 48), die während des Experiments den zweiten Endpunkt nicht erreichten (n = 12), keine Anzeichen von PAH entwickelten (n = 4) oder unter unkontrollierten Bedingungen starben (n = 2), wurden von der Studie ausgeschlossen.Hämodynamische UntersuchungAm Tag der Tötung wurden die Ratten einer invasiven hämodynamischen Untersuchung unterzogen. Die Tiere wurden mit Natriumpentobarbital (30 mg/kg Körpergewicht, Biowet, Polen) anästhesiert, das intraperitoneal verabreicht wurde, und während des gesamten Eingriffs mechanisch beatmet, wobei ein druckgesteuertes Beatmungsgerät mit einem Gemisch aus Luft und Sauerstoff (80–90 %) und Isofluran (2–2,5 %, Baxter, Polen) verwendet wurde, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten. Bei Bedarf wurden zusätzliche Bolusdosen Natriumpentobarbital verabreicht. Nach der Infiltration der Operationsstelle mit Lidocain (20 mg/ml, B. Braun Melsungen AG, Deutschland) wurde der Brustkorb über eine linke und rechte Minithorakotomie am sechsten Interkostalraum geöffnet. Anschließend wurden zwei heparinisierte 21G-Venenkanülen, die an ein Druckaufzeichnungssystem angeschlossen waren, über die Herzspitze in den rechten und linken Ventrikel eingeführt, um den systolischen und diastolischen Blutdruck zu messen (Siemens SC 7000, Erlangen, Deutschland)  22  .Euthanasie und Sektion von TierenRatten wurden nach hämodynamischer Untersuchung durch eine Überdosis Natriumpentobarbital durch intraperitoneale Verabreichung getötet. Unmittelbar nach der Bestätigung der Beendigung der Vitalfunktionen wurde die Brusthöhle vollständig geöffnet. Blutproben wurden durch Aortenpunktion entnommen und in Röhrchen mit K2-EDTA-Antikoagulans (Sarsted, Deutschland) gesammelt. Dann wurde das Herz mit großen Mengen Ringer-Lösung (Fresenius Kabi, Deutschland) infundiert, um das Myokard von Blut zu reinigen. Anschließend wurde das Herz mithilfe eines Stereomikroskops seziert und trockengetupft.Die Gewebe der freien Wände und der interventrikulären Septen des linken und rechten Ventrikels wurden vollständig voneinander und von den übrigen Herzstrukturen getrennt. Anschließend wurden die freien Wände gewogen und gemessen. Abschließend wurden die Proben in ausreichend große Abschnitte unterteilt und in Isopentan eingefroren, das mit flüssigem Stickstoff gekühlt wurde. Anschließend wurden sie bis zur nächsten Analyse bei −80 °C gelagert oder in einer 10 % gepufferten Paraformaldehydlösung fixiert. Blutproben wurden zentrifugiert, Plasma wurde in Aliquots aufgeteilt und bei −80 °C eingefroren.Auswahl des StudienmaterialsNeben seiner pneumotoxischen Wirkung hat Monocrotalin auch direkte kardiotoxische Wirkungen, die sich in Form einer Myokarditis äußern. Eine direkte myokardiale Toxizität von Monocrotalin kann zu Herzversagen führen, welches das Bild der für pulmonale Hypertonie typischen Läsionen verzerren kann  23  . Zur Bewertung der Anzeichen einer lokalen Gewebeentzündung wurde eine histologische Aufarbeitung durchgeführt. Mit Paraformaldehyd fixierte Proben wurden in einer Reihe von Alkoholen dehydriert, mit Xylol geklärt und in Paraffinblöcke eingebettet. Die Proben wurden in 6-µm-Schnitte geschnitten (Mikrotom Leica RM2146, Deutschland) und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt (Sigma-Aldrich, Deutschland). In Proben mit durch Monocrotalin verursachter Myokarditis wurde die Infiltration der Entzündungszellen semiquantitativ (0 = nicht vorhanden, 1 = gering, 2 = mittel, 3 = hoch, 4 = schwer) mit einem Lichtmikroskop (Nikon E600, Japan) beurteilt, um einige von ihnen von der weiteren Analyse auszuschließen. Nur Proben mit weniger als mittelschweren Anzeichen einer Myokarditis wurden verarbeitet und weiteren Analysen unterzogen.Unter den Ratten, die eine frühe PAH entwickelten (n = 12 Tiere), zeigte keine Anzeichen einer lokalen Gewebeentzündung. Insgesamt wurden acht Proben aus dieser Kohorte zufällig für weitere Analysen ausgewählt und mit acht zeitlich gepaarten Ratten aus der Kontrollgruppe verglichen. Unter den 18 Tieren mit Herzinsuffizienz im Endstadium zeigten fünf signifikante Anzeichen einer Myokarditis. Acht Proben wurden zufällig aus der Kohorte im Endstadium für weitere Analysen ausgewählt und mit acht zeitlich gepaarten Ratten aus der Kontrollgruppe verglichen. Als Ergebnis haben wir die folgenden vier Gruppen unterschieden (jeweils n = : Ratten mit früher PAH (Gruppe I), Kontrollratten, die zeitlich mit Tieren mit früher PAH gepaart waren (Gruppe II), Ratten mit Endstadium PAH (Gruppe III) und Kontrollratten, die zeitlich mit Tieren mit Endstadium PAH gepaart waren (Gruppe IV).Bestimmung von PlasmamarkernDie Konzentration ausgewählter Substanzen im Plasma getöteter Ratten wurde mittels Enzymimmunoassay (ELISA) nach Herstellerangaben bestimmt. Untersucht wurden folgende Substanzen:

• N-terminales Pro-B-Typ natriuretisches Peptid (NT-proBNP) als Surrogatmarker für den Schweregrad einer Herzinsuffizienz (Rat NT-proBNP ELISA Kit, LifeSpan BioSciences, USA)
• Serpinpeptidase-Inhibitor, ein Mitglied der Gruppe A 3 (SERPINA3), das als Inhibitor verschiedener Serinproteasen (hauptsächlich Cathepsin G) wirkt, die während der Entzündung freigesetzt werden und am Gewebeabbau beteiligt sind. Hohe Konzentrationen sind mit einem schlechten klinischen Ergebnis bei Herzinsuffizienz verbunden (Rat Serpina3n ELISA Kit, LifeSpan BioSciences, USA).
• Endothelin-1, ein wichtiger Mediator in der Pathogenese von PAH (Endothelin-1 Quantikine ELISA Kit, Bio-Techne, USA)
• Interleukin-6, ein entzündliches Zytokin, das die Entwicklung und das Fortschreiten der pulmonalen Gefäßumgestaltung und der Herzinsuffizienz fördert (Rat Interleukin-6 ELISA Kit, Sigma, Deutschland)

Autophagie-BeurteilungMarkerproteine ​​des Autophagieprozesses wurden mithilfe einer Western-Blot-Technik analysiert. Protein wurde aus 32 Proben des linken Ventrikels mithilfe eines Signal Seeker Ubiquitin Enrichment Kit (Cytoskeleton, CO, USA) isoliert. Die erhaltenen Proteinlysate (40 µg) wurden dann mit 2× Laemmli-Ladepuffer (Biorad, CA, USA) 5 Minuten lang bei 95 °C denaturiert. Die SDS-PAGE-Elektrophorese wurde auf einem 4–20 % Gradientengel durchgeführt, gefolgt von der Übertragung der Proteine ​​vom Gel auf eine Polyvinylidenfluoridmembran (PVDF) (Biorad, CA, USA). Die Membranen wurden über Nacht bei 4 °C mit 5 % Magermilch, gelöst in TBST-Puffer, blockiert.Die Inkubation mit primären Antikörpern gegen LC3B-Proteine ​​(Verdünnung 1:1000, Cell Signaling, MA, USA) erfolgte über Nacht bei 4 °C. Nach dem Waschen wurden die Membranen 2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit geeigneten sekundären Antikörpern (Verdünnung 1:5000, Abcam, Vereinigtes Königreich), die mit Meerrettichperoxidase konjugiert waren, inkubiert. Nach dem Waschen wurde ECL-Substrat (Biorad, CA, USA) hinzugefügt und das Chemilumineszenzsignal mit einem EC3 Imaging System (UVP, CA, USA) erfasst. Beta-Aktin wurde als endogenes Referenzprotein verwendet. Mit Chloroquin behandeltes Hela-Lysat und unbehandeltes HELA-Lysat (NOVUS Biologicals, CO, USA) wurden als positive bzw. negative Kontrollen für den Autophagieprozess verwendet. Die spezielle Software des EC3 Imaging Systems (UVP, CA, USA) wurde für die densitometrische Analyse verwendet.Die Immunfluoreszenzfärbung wurde durchgeführt, nachdem gefrorene Proben mit einigen Tropfen Gewebegefriermedium (Tissue Tek; Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Niederlande) auf einem Kryostathalter befestigt wurden. Serienschnitte (10 μm dick) wurden bei −20 °C in einem Kryostaten (Slee MEV, Mainz, Deutschland) geschnitten und gefrorene Schnitte wurden in Methanol fixiert und 30 Minuten lang in 5 % normalem Ziegenserum inkubiert. Sie wurden dann über Nacht bei 4 °C mit dem primären Antikörper, dem polyklonalen Antikörper Anti-LC3B (Verdünnung 1:200, Cell Signaling, 2775), inkubiert.Nach mehreren Waschvorgängen in 0,01 M Natriumphosphatpuffer mit 0,05 % Triton-X wurden die Abschnitte über Nacht bei 4 °C mit sekundären Ziegen-Anti-Maus-Antikörpern, konjugiert mit Alexa Fluor 488 (Verdünnung 1:1000, Thermo Fisher Scientific A11001), und sekundären Ziegen-Ameise-Kaninchen-Antikörpern, konjugiert mit Alexa Fluor 555 (Verdünnung 4:1000, Thermo Fisher Scientific A21428), inkubiert. Nach dem letzten Waschvorgang wurden die Präparate in Vectashield mit DAPI-Medium (Vector Labs, Burlingame, CA, USA) montiert und mit einem konfokalen Laser-Rastermikroskop (FluoView1200, Olympus, Japan) untersucht, um die Zunahme der Punktsammlung von markiertem LC3B-Protein festzustellen. Die Proben wurden blind als solche mit niedriger, mittlerer oder hoher LC3-Punkthäufigkeit bewertet, indem 5 verschiedene Felder für jede linksventrikuläre Probe ausgewertet wurden.Bewertung des Ubiquitin-abhängigen ProteolyseprozessesUm die Intensität des Ubiquitin-abhängigen Proteolyseprozesses im linken Ventrikel zu beurteilen, wurde der Gehalt an ubiquitiniertem Protein in 32 Proben aus dem linken Ventrikel quantitativ analysiert. Zunächst wurden ubiquitinierte Proteine ​​mithilfe eines Signal Seeker Ubiquitin Enrichment Kit (Cytoskeleton, CO, USA) immunpräzipitiert. Die erhaltenen Proteinfraktionen wurden wie oben beschrieben einem Western-Blot-Verfahren unterzogen. Alle ubiquitinierten Proteine ​​auf PVDF-Membranen wurden mithilfe von Meerrettichperoxidase-konjugierten Anti-Ubiquitin-Antikörpern (Verdünnung 1:2000, Precision Red Advanced Protein Assay, Signal Seeker Ubiquitin Enrichment Kit, Cytoskeleton, CO, USA) nachgewiesen. Nach Zugabe des ECL-Substrats (Biorad, CA, USA) wurde das Chemilumineszenzsignal mit einem EC3 Imaging System (UVP, CA, USA) abgelesen und eine densitometrische Analyse durchgeführt.Statistische AnalysenDie Daten wurden mit der Software StatSoft STATISTICA 13.5 für Windows (StatSoft Inc., Tulsa, OK) analysiert. Die Daten werden als Mittelwerte mit den entsprechenden Standardabweichungen (SDs) dargestellt. Der Shapiro-Wilk-Test wurde verwendet, um zu bestimmen, ob quantitative Daten normal verteilt waren. Vergleiche wurden je nach Normalität der Verteilungen mit einem T-Test oder einem Mann-Whitney-Test durchgeführt. An logarithmisch transformierten Daten wurde eine einfaktorielle ANOVA mit Tukeys Post-hoc-Tests durchgeführt. Ein p- Wert unter 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.Ethische GenehmigungDiese Studie wurde vom 2. Lokalen Ethikkomitee in Krakau, Polen (Nr. 60/2016) genehmigt und gemäß den Richtlinien der Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere durchgeführt.ErgebnisseEchokardiographische, hämodynamische und morphometrische ParameterDie mittlere Versuchsdauer (von Tag 0 bis zur Euthanasie) betrug in der Gruppe mit früher PAH 22,0 ± 1,5 Tage, während sie in der Gruppe mit PAH im Endstadium 37,0 ± 7,1 Tage betrug. Die an den Tötungstagen erhaltenen echokardiografischen, hämodynamischen und morphometrischen Parameter sind in Tabelle  1  aufgeführt . Die echokardiografische Untersuchung in vivo zeigte eine signifikante Verdickung der freien Wand des rechten Ventrikels ab dem frühen PAH-Stadium (frühe PAH: 0,76 ± 0,07 vs. 0,59 ± 0,09 mm, p  < 0,001; PAH im Endstadium: 1,09 ± 0,09 vs. 0,64 ± 0,05 mm, p  < 0,001). Das echokardiographische Bild des linken Ventrikels zeigte keinen Unterschied zwischen PAH im Frühstadium und entsprechenden Kontrollratten (enddiastolische freie Wanddicke des linken Ventrikels: 2,13 ± 0,61 vs. 2,02 ± 0,82 mm, p  = 0,781).Tabelle 1 Echokardiographische, hämodynamische und morphometrische Parameter, gemessen am Tag der Euthanasie (Mittelwert ± SD). Darüber hinaus zeigte sich in der PAH-Gruppe im Endstadium eine deutliche, aber statistisch nicht signifikante Reduktion der echokardiographisch ermittelten enddiastolischen Wanddicke des linken Ventrikels (1,84 ± 1,10 vs. 2,16 ± 0,65 mm, p  = 0,509). Die gemessenen TAPSE- und PAAT/CL-Parameter deuteten auf die Entwicklung einer signifikanten pulmonalen Hypertonie in der PAH-Gruppe im Endstadium hin (Tabelle  1  ). Die gemessenen hämodynamischen Parameter zeigten eine allmählich zunehmende Druckbelastung des rechten Ventrikels mit Fortschreiten der PAH (rechtsventrikulärer systolischer Druck in der PAH-Gruppe im Frühstadium: 27,80 ± 4,53 vs. 19,20 ± 6,02 mmHg, p  = 0,005; PAH-Gruppe im Endstadium: 53,10 ± 13,30 vs. 23,80 ± 3,61 mmHg, p  < 0,001). Darüber hinaus wurde in der PAH-Gruppe im Endstadium eine deutlich beeinträchtigte systolische Funktion des linken Ventrikels festgestellt (44,28 ± 11,93 vs. 91,71 ± 14,84 mmHg, p  < 0,001). Im Frühstadium der PAH-Entwicklung wurde keine derartige Abweichung festgestellt (88,22 ± 9,98 vs. 90,50 ± 14,21 mmHg, p  = 0,715) (Tabelle  1  ).Bei der Autopsie wurde sowohl bei Ratten mit PAH im Früh- als auch im Endstadium eine signifikante Zunahme der Myokardmasse im rechten Ventrikel festgestellt (0,22 ± 0,04 vs. 0,18 ± 0,02 g, p  = 0,024 bzw. 0,36 ± 0,07 vs. 0,17 ± 0,05 g, p  < 0,001). Dies ging mit einer sichtbaren Verdickung des Myokards im rechten Ventrikel einher (frühe PAH: 0,87 ± 0,19 vs. 0,57 ± 0,21 mm, p  = 0,001, PAH im Endstadium: 1,13 ± 0,20 vs. 0,60 ± 0,14 mm, p  < 0,001). Andererseits wurde in der PAH-Gruppe im Endstadium im Vergleich zu den Kontrollgruppen eine signifikante Abnahme der Myokardmasse des linken Ventrikels festgestellt (0,24 ± 0,04 vs. 0,38 ± 0,09, p  = 0,001) (Tabelle  1  ).PAH und Herzinsuffizienz-PlasmamarkerIm Verlauf der PAH wurde ein signifikanter Anstieg der Plasmakonzentration von NT-proBNP festgestellt, was die Entwicklung einer schweren Herzinsuffizienz bestätigte ( p  < 0,0001, Abb.   1  A). Die Konzentrationen der anderen drei analysierten Plasmafaktoren SERPINA3, Endothelin-1 und Interleukin-6 zeigten im frühen PAH-Stadium im Vergleich zu den Kontrollen keine statistisch signifikante Veränderung (alle p  > 0,05, Abb.   1  BD). Dennoch wiesen Proben von Ratten mit PAH im Endstadium deutlich höhere Konzentrationen von SERPINA3, Endothelin-1 und Interleukin-6 im Vergleich zu gesunden Tieren auf (alle p  < 0,05) (Abb.   1  B–D).Abbildung 1

Box- und Whisker-Plots zum Vergleich der Plasmawerte von ( A ) NT-proBNP, ( B ) SERPINA3, ( C ) Endothelin-1 und ( D ) Interleukin-6 bei PAH im Frühstadium, PAH im Endstadium und entsprechenden Kontrolltieren. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt, n = 8 pro Gruppe. Statistische Analysen wurden je nach Normalität der Verteilungen mit einem T-Test oder einem Mann-Whitney-Test durchgeführt. Kontrolle 1 – Kontrollratten, die zeitweise mit Tieren im Frühstadium von PAH gepaart waren, Kontrolle 2 – Kontrollratten, die zeitweise mit Tieren im Endstadium von PAH gepaart waren. Beurteilung des Autophagieprozesses durch Western BlottingWir haben die LC3B-I- und LC3B-II-Werte durch Western-Blot-Analyse des Myokards des linken Ventrikels von PAH-Ratten und entsprechenden Kontrolltieren ermittelt (Abb.   2  ). Die Ergebnisse für LC3 wurden quantitativ analysiert, wobei Beta-Actin als Normalisierungsprotein verwendet wurde (Abb.   2  D). LC3 wurde als zwei Banden nachgewiesen: zytosolisches LC3B-I und Membran-LC3B-II. Die Autophagie kann durch Verfolgung des Umwandlungsgrads von LC3B-I in LC3B-II beurteilt werden.Figur 2

Bewertung des Autophagieprozesses des linken Ventrikelmyokards mittels Western Blotting. ( A ) Kardialer LC3B-I-Ausdruck mittels Western Blotting bewertet und relativ zum Beta-Actin-Gehalt in früher PAH, PAH im Endstadium und entsprechenden Kontrollen ausgedrückt. ( B ) Kardialer LC3B-I-Ausdruck mittels Western Blotting bewertet und relativ zum Beta-Actin-Gehalt in früher PAH, PAH im Endstadium und entsprechenden Kontrollen ausgedrückt. ( C ) LC3B-II/LC3B-I/Beta-Actin-Verhältnis mittels Western Blotting in allen analysierten Gruppen bewertet. ( D ) Repräsentativer Western Blot, der den Ausdruck von LC3BI/II in allen analysierten Gruppen zeigt (beschnittene Blots); die Original-Blots sind in den ergänzenden Abbildungen 2–5 dargestellt. N = 8 pro Gruppe. Die Ergebnisse wurden relativ zur positiven Kontrolle berechnet, unter der Annahme, dass der Ausdruck der positiven Kontrolle 100 % betrug. Die statistischen Analysen wurden mit einfaktorieller ANOVA und Tukey-Post-hoc-Test durchgeführt; Signifikanz: * p  < 0,05 PAH im Endstadium gegenüber PAH im Frühstadium bei der LC3B-II-Proteinexpression, * p  < 0,05 PAH im Endstadium gegenüber Kontrolle 2 beim LC3B-II/LC3B-I-Verhältnis. Kontrolle 1 – Kontrollratten, die zeitlich mit Tieren im Frühstadium von PAH gepaart waren, Kontrolle 2 – Kontrollratten, die zeitlich mit Tieren im Endstadium von PAH gepaart waren. Es wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede im LC3B-I-Ausdruck in der Gruppe mit früher PAH im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen, in der Gruppe mit PAH im Endstadium im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen und in der Gruppe mit früher PAH im Vergleich zu PAH im Endstadium festgestellt (Abb.   2  A). Andererseits war der LC3B-II-Ausdruck in den Myokardproben des linken Ventrikels bei Ratten mit PAH im Endstadium signifikant höher als in der Gruppe mit früher PAH (Abb.   2   ( p  = 0,040). Darüber hinaus waren die LC3B-II/LC3B-I-Verhältnisse in den PAH-Proben im Endstadium im Vergleich zu denen der gesunden Kontrollpersonen signifikant erhöht (Abb.   2  C) ( p  = 0,039). Im Zusammenhang mit der Autophagie weist ein Anstieg der LC3B-II-Werte oder ein höheres LC3B-II/LC3B-I-Verhältnis auf eine Hochregulierung der Autophagieaktivität hin.Histologische AnalyseDie Hämatoxylin-Eosin-Färbung der Proben zeigte erhebliche strukturelle Veränderungen des Myokards des linken Ventrikels bei Patienten mit PAH im Endstadium (Abb.   3  ). Bei Tieren im Endstadium von PAH wurden im Vergleich zu den Kontrollgruppen ohne PAH und der Gruppe mit früher PAH eine Verringerung der Größe der Kardiomyozyten und ein erhöhtes Bindegewebsvolumen beobachtet (Abb.   3  ). Zur Beurteilung der Autophagie-Reaktion in den Proben wurde eine Anti-LC3B-Immunfluoreszenzfärbung durchgeführt (Abb.   4  ). Ein signifikanter Unterschied in der Häufigkeit von LC3-Puncta wurde festgestellt, als man den linken Ventrikel in der Gruppe mit PAH im Endstadium (alle Proben wiesen eine hohe Häufigkeit von LC3-Puncta auf, Abb.   4  C) mit den entsprechenden Kontrollgruppen (alle Proben wiesen eine geringe oder keine Häufigkeit auf, Abb.   4  A) und den Patienten mit früher PAH (75 % der Proben wiesen eine geringe Häufigkeit und 25 % eine mäßige Häufigkeit auf, Abb.   4   verglich.Figur 3

Repräsentative histologische Bilder des Myokards des linken Ventrikels. Histologische Querschnitte von mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbten Proben des linken Ventrikels aus ( A ) der Kontrollgruppe ohne PAH, ( B ) der frühen PAH und ( C ) der PAH-Gruppe im Endstadium. Mit Paraformaldehyd fixierte Proben des linken Ventrikels wurden in einer Reihe von Alkoholen dehydriert, in Xylol geklärt und in Paraffinblöcke eingebettet. Die Proben wurden in 6-µm-Schnitte geschnitten (Mikrotom Leica RM2146, Deutschland) und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt (Sigma-Aldrich, Deutschland). Figur 4

Repräsentative Immunfluoreszenzbilder, die die Häufigkeit von LC3 im linken Ventrikel zeigen ( A ) Kontrollgruppe ohne PAH (geringe Häufigkeit von LC3-Punkten) und ( B ) PAH-Gruppe im Frühstadium und ( C ) PAH-Gruppe im Endstadium (hohe Häufigkeit von LC3-Punkten). Die Immunfluoreszenzfärbung wurde an gefrorenen Proben aus dem linken Ventrikel durchgeführt; polyklonaler Anti-LC3B-Antikörper (Verdünnung 1:200, Cell Signaling, 2775), sekundärer Ziegen-Anti-Maus-Antikörper konjugiert mit Alexa Fluor 488 (Verdünnung 1:1000, Thermo Fisher Scientific A11001) und sekundärer Ziegen-Ameise-Kaninchen-Antikörper konjugiert mit Alexa Fluor 555 (Verdünnung 4:1000, Thermo Fisher Scientific A21428), DAPI-Medium (Vector Labs, Burlingame, CA, USA). Ubiquitin-abhängiger Proteolyseprozess im linken VentrikelEs gab keinen statistisch signifikanten Unterschied in den Expressionsniveaus aller ubiquitinierten Proteine, normalisiert auf 1 mg Protein, das für die Immunpräzipitation verwendet wurde, wenn man die PAH-Gruppen mit den entsprechenden Kontrollen vergleicht (ANOVA, p  = 0,332) (Abb.   5  ). Die mittlere Dichtefläche aller ubiquitinierten Proteine ​​für die PAH-Gruppe im Endstadium betrug 10967,0, was sich statistisch nicht von den Kontrollen (4424,8; p  = 0,32) und der PAH-Gruppe im Frühstadium (6829,1; p  = 0,631) unterschied.Abbildung 5

Ubiquitinabhängiger Proteolyseprozess im linken Ventrikel, beurteilt durch Immunpräzipitation ubiquitinierter Proteine. Expressionsniveaus ubiquitinierter Proteine, normalisiert auf 1 mg Protein, das zur Immunpräzipitation bei früher PAH, PAH im Endstadium und entsprechenden Kontrollen verwendet wurde. N = 8 pro Gruppe. Statistische Analysen wurden mit einfaktorieller ANOVA und Tukey-Post-hoc-Test durchgeführt. Repräsentativer Western Blot, der die Expression ubiquitinierter Proteine ​​in allen analysierten Gruppen zeigt (beschnittener Blot); Original-Blots sind in den ergänzenden Abbildungen 2–5 dargestellt. Kontrolle 1 – Kontrollratten, die zeitlich mit Tieren im frühen PAH-Stadium gepaart waren, Kontrolle 2 – Kontrollratten, die zeitlich mit Tieren im Endstadium PAH gepaart waren. DiskussionDie molekularen Prozesse, die der Umgestaltung des linken Ventrikels im Verlauf von PAH zugrunde liegen, sind immer noch wenig verstanden. Insbesondere ist über die Mechanismen der Atrophie des linken Ventrikels wenig bekannt  17  ,  24  . Daher wollten wir molekulare Mechanismen finden, die für den Verlust an linksventrikulärer Myokardmasse im Verlauf von PAH verantwortlich sein könnten. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass Autophagie im Endstadium von PAH als einer dieser Mechanismen angesehen werden kann, während die Ubiquitin-abhängige Proteolyse bei diesem Phänomen keine bedeutende Rolle zu spielen scheint. Unsere vorherige Studie hat gezeigt, dass die Atrophie des linken Ventrikels bei PAH mit einer erhöhten Aktivität apoptotischer Signalwege und verstärkter Fibrose verbunden ist  17  , was darauf hindeuten könnte, dass im Endstadium von PAH eine Wechselwirkung zwischen den Abbaumechanismen von Autophagie und Apoptose im linken Ventrikel besteht.Zu den angenommenen Ursachen der Atrophie des linken Ventrikels bei PAH gehört eine Verringerung der Anfangsbelastung der linken Herzhälfte (hämodynamischer Stress). Ein anderer möglicher Mechanismus des Masseverlusts des linken Ventrikels bei PAH hängt mit allgemeiner Hypoxie und Ischämie des Myokards infolge einer Herzinsuffizienz des rechten Ventrikels (metabolischer Stress) zusammen  25  . In einem Modell eines hämodynamisch unbelasteten Herzens wurde gezeigt, dass Autophagie eine bedeutende Rolle beim Abbau der Zellkomponenten von Kardiomyozyten spielt. Im Gegensatz dazu weist ein versagendes menschliches Herz bereits erhöhte Werte von Autophagiemarkern auf, aber nach der Implantation eines Linksherzunterstützungssystems werden diese Autophagiemarker herunterreguliert  25  . Dies deutet darauf hin, dass Autophagie an den Reaktionsprozessen des Myokards auf Bedingungen hämodynamischer Belastung beteiligt ist, die auch im Fall von PAH auftreten können.Apoptose und Autophagie sind wichtige Prozesse für die korrekte Entwicklung von Organismen und haben entscheidende Auswirkungen auf das Zellschicksal. Zahlreiche Studien zeigen, dass verschiedene Reize sowohl Autophagie als auch Apoptose aktivieren können, und trotz der deutlichen Unterschiede zwischen diesen beiden Prozessen hängt ihre Regulierung auf molekularer Ebene zusammen  26  ,  27.  Im Zusammenhang mit Zelltod können zwei Hauptarten der Interaktion zwischen Autophagie und Apoptose unterschieden werden. Beim ersten sind Autophagie und Apoptose Partner, die auf koordinierte und kooperative Weise agieren. In diesem Fall wirken Autophagie und Apoptose zusammen oder als zwei unabhängige Wege und können zur Zelleliminierung führen. Beim zweiten Mechanismus ermöglicht die Autophagie den Prozess der Apoptose. In einem solchen Szenario führt die Autophagie nicht per se zum Zelltod, aber sie vermittelt die Todesinduktion im Prozess der Apoptose  28  .Unsere Studie liefert außerdem mehrere andere wichtige Beobachtungen hinsichtlich der Umgestaltung des linken Ventrikels während PAH. Erstens kam es in der PAH-Gruppe im Endstadium zu einer deutlich beeinträchtigten systolischen Funktion des linken Ventrikels, während in der PAH-Gruppe im Frühstadium keine derartige Veränderung sichtbar war (Tabelle  1  ). Im Verlauf der durch Monocrotalin induzierten PAH wurde auch eine erhebliche echokardiografische und morphologische Umgestaltung des linken Ventrikels beobachtet (Tabelle  1  ). Darüber hinaus war im Endstadium der PAH das Myokard des linken Ventrikels fibrotischer, und die Größe der Kardiomyozyten war sowohl im Vergleich zu den Patienten ohne PAH als auch im Frühstadium der PAH deutlich reduziert. Sowohl eine Verringerung der Größe der Kardiomyozyten, deren Ersatz durch weniger dichtes, starreres und weniger funktionelles fibrotisches Gewebe als auch der Verlust von myokardialen Strukturproteinen  17  können die beobachtete Abnahme der Masse des linken Ventrikels erklären. Dies ging mit einem signifikanten Anstieg wichtiger Plasmamarker einher, die mit PAH und Herzinsuffizienz in Zusammenhang stehen. Ein solcher Anstieg wurde allerdings erst spät in der letzten PAH-Phase beobachtet (Abb.   1  ). Dies zeichnet das Bild einer erheblichen Beeinträchtigung des linken Ventrikels, die in den Endstadien der PAH als Folge der Rechtsherzinsuffizienz auftritt.Die vorliegende Studie unterliegt mehreren Limitationen, und die wichtigste besteht darin, dass sich die Ergebnisse von Tierversuchen nicht vollständig auf klinische Manifestationen von Krankheiten beim Menschen übertragen lassen. In dieser Studie haben wir ein Monocrotalin-Modell für PAH verwendet. Es ist hinlänglich belegt, dass Monocrotalin Endothelzellschäden induziert, die zu einer Umgestaltung der Lungengefäße, erhöhtem Gefäßwiderstand und damit zur Entwicklung von PAH sowie kardiotoxischen Effekten, die sich als Myokarditis äußern, führen. Eine direkte Toxizität von Monocrotalin auf das Myokard kann zu Herzinsuffizienz führen (unabhängig von den durch PAH bedingten hämodynamischen Veränderungen), was das Bild von Läsionen verzerren kann, die nur für pulmonale Hypertonie charakteristisch sind  23  . Um diese Verzerrung zu minimieren, haben wir ein Vorauswahlprotokoll implementiert, das Proben mit Anzeichen einer Myokarditis aussortiert, womit der größte Teil der negativen Auswirkungen von Monocrotalin in dieser Hinsicht beseitigt worden sein sollte.Darüber hinaus muss betont werden, dass sich im PAH-Modell die Entwicklung einer Herzinsuffizienz im Endstadium viel schneller vollzieht als im natürlichen Verlauf dieser Erkrankung beim Menschen  20  . Dennoch ist das monocrotaline Rattenmodell der PAH ein weithin akzeptiertes und häufig verwendetes Versuchsmodell, ohne das ähnliche Forschungen nicht durchgeführt werden könnten  29  . Herzgewebeproben von lebenden Patienten mit unterschiedlichen PAH-Stadien und gesunden Kontrollpersonen sind ohne ein erhebliches Risiko für die Studienteilnehmer nicht erhältlich.Trotz dieser Einschränkungen weist unsere Studie mehrere wichtige Stärken auf. Die wichtigste davon ist, dass sie nicht nur das Endstadium der PAH-induzierten Herzinsuffizienz analysiert hat, sondern auch die Myokardveränderungen im linken Ventrikel im frühen Verlauf der PAH-Progression. Darüber hinaus haben wir viele verschiedene Techniken zur Aufzeichnung von PAH-bezogenen Veränderungen implementiert, darunter Echokardiographie, hämodynamische Messungen, morphometrische Beurteilung, histologische Verarbeitung mit Immunfluoreszenzfärbung, Beurteilung von Plasmamarkern der Herzinsuffizienz, Autophagie-Bewertung durch Western Blotting und immunpräzipitationsbasierte Schätzung ubiquitinierter Proteine. Schließlich stimmt das Design unserer Studie mit anderen Studien überein, die durch Monocrotalin induzierte PAH-Modelle verwenden, sodass direkte Studienvergleiche möglich sind.AbschlussIm Verlauf einer durch Monocrotalin induzierten PAH ist eine erhebliche morphologische und hämodynamische Umgestaltung des linken Ventrikels zu beobachten. Das Endstadium der PAH ist mit einer deutlich beeinträchtigten systolischen Funktion des linken Ventrikels und einer erheblichen Abnahme der Myokardmasse des linken Ventrikels verbunden. Autophagie kann als Mechanismus hinter dem linksventrikulären Massenverlust im Endstadium der PAH angesehen werden, während die ubiquitinabhängige Proteolyse in diesem Prozess keine wichtige Rolle zu spielen scheint. Das Erlernen der Mechanismen des Massenverlusts des linken Ventrikels kann einen Ankerpunkt für neue Therapien für Patienten mit pulmonaler Hypertonie darstellen und unser Wissen über die Zusammenarbeit verschiedener Stoffwechselwege bei der Myokardplastizität erheblich erweitern.