RNA-Molekül FGF21 könnte ein therapeutisches Ziel sein bei PH

onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/jcmm.17318FGF21 lindert Lungenhochdruck, indem es den mTORC1/EIF4EBP1-Weg über H19 hemmtAbstraktLange nichtkodierende RNAs (lncRNAs) spielen eine bedeutende Rolle bei der pulmonalen Hypertonie (PH). Unsere vorläufigen Daten zeigten, dass die Hypoxie-induzierte PH durch die Verabreichung des Fibroblasten-Wachstumsfaktors 21 (FGF21) abgeschwächt wird. Daher haben wir die regulatorische Rolle von langen nicht-kodierenden RNAs bei mit FGF21 behandelter PH weiter untersucht. RNA-Sequenzanalyse und Echtzeit-PCR identifizierten eine signifikante Hochregulierung des H19 nach FGF21-Verabreichung. Darüber hinaus zeigten Gain- und Loss-of-Function-Assays, dass FGF21 die durch Hypoxie induzierte Proliferation glatter Muskelzellen der Pulmonalarterie teilweise durch Hochregulierung von H19 unterdrückte. Darüber hinaus verschlimmerte FGF21-Mangel deutlich Hypoxie-induzierte Anstiege des Lungenarteriendrucks und des pulmonalen Gefäßumbaus. Zusätzlich, Die AAV-vermittelte H19-Überexpression kehrte den malignen Phänotyp von FGF21-Knockout-Mäusen unter Hypoxie-Exposition um. Weitere Untersuchungen ergaben, dass H19 auch als Orchesterdirigent fungierte, der die Funktion des mechanistischen Ziels des Rapamycinkomplexes 1 (mTORC1) hemmte, indem er die Wechselwirkung von mTORC1 mit dem eukaryotischen Translationsinitiationsfaktor 4E-Bindungsprotein 1 (EIF4EBP1) störte. Unsere Arbeit unterstreicht die wichtige Rolle von H19 bei mit FGF21 behandelter PH und schlägt einen Mechanismus vor, der die Hemmung von mTORC1/EIF4EBP1 beinhaltet, was eine Grundlage für die klinische Anwendung von FGF21 bei PH darstellen könnte. Weitere Untersuchungen ergaben, dass H19 auch als Orchesterdirigent fungierte, der die Funktion des mechanistischen Ziels des Rapamycinkomplexes 1 (mTORC1) hemmte, indem er die Wechselwirkung von mTORC1 mit dem eukaryotischen Translationsinitiationsfaktor 4E-Bindungsprotein 1 (EIF4EBP1) störte. Unsere Arbeit unterstreicht die wichtige Rolle von H19 bei mit FGF21 behandelter PH und schlägt einen Mechanismus vor, der die Hemmung von mTORC1/EIF4EBP1 beinhaltet, was eine Grundlage für die klinische Anwendung von FGF21 bei PH darstellen könnte. Weitere Untersuchungen ergaben, dass H19 auch als Orchesterdirigent fungierte, der die Funktion des mechanistischen Ziels des Rapamycinkomplexes 1 (mTORC1) hemmte, indem er die Wechselwirkung von mTORC1 mit dem eukaryotischen Translationsinitiationsfaktor 4E-Bindungsprotein 1 (EIF4EBP1) störte. Unsere Arbeit unterstreicht die wichtige Rolle von H19 bei mit FGF21 behandelter PH und schlägt einen Mechanismus vor, der die Hemmung von mTORC1/EIF4EBP1 beinhaltet, was eine Grundlage für die klinische Anwendung von FGF21 bei PH darstellen könnte. 1. EINLEITUNGPulmonale Hypertonie (PH) ist durch fortschreitende Vasokonstriktion und Remodellierung der Pulmonalarterie gekennzeichnet.  1  Unkontrollierte Expansion der glatten Muskelzellen der Pulmonalarterie (PASMCs), Schädigung des pulmonalvaskulären Endothels und übermäßige Ablagerung extrazellulärer Matrix sind die gemeinsamen pathologischen Kennzeichen von PH.  2  Trotz der Verfügbarkeit von Behandlungen, die eine symptomatische Linderung bewirken, gab es bis heute keine wirksame Behandlung für PH. Daher besteht immer noch ein dringender Bedarf, mögliche regulatorische Angriffspunkte zu finden, um wirksame Anti-PH-Mittel zu entwickeln.Der Fibroblasten-Wachstumsfaktor 21 (FGF21) ist ein Mitglied der Familie der endokrinen Fibroblasten-Wachstumsfaktoren, deren positive Auswirkungen auf Glukose, Fettstoffwechsel und Insulinresistenz in frühen Studien festgestellt wurden.  3  -  5  In letzter Zeit haben immer mehr Studien die Schutzfunktion von FGF21 bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen beschrieben. Beispielsweise wurde festgestellt, dass FGF21 die diabetesinduzierte endotheliale Dysfunktion in der Aorta  6  der Maus verbessert und die durch Angiotensin II induzierte Hypertonie bei Mäusen verhindert.  7  Die Rolle von FGF21 bei PH ist jedoch unklar. Unsere vorexperimentelle Forschung zeigte, dass die FGF21-Proteinexpressionsspiegel in Lungenarteriolen, Serum und Lungengewebe bei Ratten mit Hypoxie-induzierter PH (HPH) herunterreguliert waren.  8 Die exogene Verabreichung von FGF21 linderte PH und rechtsventrikuläre Hypertrophie  9  . Daher stellen wir die folgende Hypothese auf: Die FGF21  -Genexpression wird reduziert, wenn der Körper auf eine hypoxische Stimulation reagiert, und kann als Schutzfaktor im pathologischen Prozess von HPH wirken. In dieser Studie wurden FGF21-  Knockout-Mäuse verwendet, um ihre Funktion in vivo weiter zu untersuchen . Darüber hinaus wird angenommen, dass der zugrunde liegende Mechanismus der mit FGF21 behandelten PH komplex ist und sicherlich unser großes Interesse geweckt hat.In jüngster Zeit haben zahlreiche Studien zu nicht-kodierenden RNAs diese in die pathogenen Mechanismen vieler Krankheiten involviert.  10  -  12  Lange nicht-kodierende RNAs (LncRNAs) sind eine Klasse verschiedener nicht-kodierender RNA-Transkripte mit einer Länge von mehr als 200 Nukleotiden (nt) und ohne Potenzial zur Proteinkodierung.  13  Die Rolle von lncRNA bei PH hat ein breites Interesse geweckt, was zu einer umfassenden Verwendung von Hochdurchsatz-Sequenzierung zur Charakterisierung des Transkriptomprofils von lncRNAs geführt hat, die mit PH assoziiert sind.  14  ,  15  Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass verschiedene lncRNAs, wie lncRNA MEG3 und lncRNA MANTIS, eine Schlüsselrolle bei der Entstehung und Entwicklung von PH spielen.  16  ,  17 In der vorliegenden Studie wurden Veränderungen der lncRNA-Expressionsprofile nach Behandlung mit FGF21 bei PH durch RNA-Sequenzierung nachgewiesen. Unter den am stärksten hochregulierten lncRNA-Transkripten nach der Behandlung mit FGF21 wurde lncRNA H19 (H19) validiert und für weitere Studien ausgewählt. H19 ist ein hoch konserviertes geprägtes Gen, das sich in der 11p15·5-Region des Chromosoms befindet.  18  Studien von Li et al.  19  und Maegdefessel et al.  20  zeigten, dass H19 an der Regulation pathophysiologischer Prozesse wie Hypoxie und Apoptose in Kardiomyozyten und glatten Muskelzellen der abdominalen Aorta beteiligt ist. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass H19 eine wichtige Rolle bei der mit FGF21 behandelten PH spielen könnte.Über die regulatorische Rolle und die Mechanismen von H19 bei mit FGF21 behandelter PH ist jedoch wenig bekannt. In dieser Studie fanden wir heraus, dass FGF21 die H19-Expression fördert und dass H19 als Schlüsselschutzfaktor fungiert, der an der Behandlung von PH durch FGF21 beteiligt ist. Wir untersuchten auch die Wirkung von H19 bei PH, die mit FGF21 behandelt wurde, durch funktionale Überprüfung und Identifizierung der beteiligten nachgeschalteten Mechanismen.2 MATERIAL UND METHODEN2.1 Tiere und HPH-ModelleC57BL/6J-Hintergrund -FGF21-  KO-Mäuse wurden als Geschenk von Dr. Steve Kliewer (University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, USA) erhalten. Männliche C57BL/6-Mäuse und männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden vom Animal Center der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China) erworben. Alle Tiere durften sich vor der Verwendung mindestens eine Woche lang an die spezifische pathogenfreie Tiereinrichtung akklimatisieren. Alle Verfahren wurden unter strikter Einhaltung der relevanten Vorschriften durchgeführt, die von der Tierethikkommission der Wenzhou Medical University genehmigt wurden.Die Konstruktion des HPH-Mausmodells wurde zuvor beschrieben.  21  Kurz gesagt, C57BL/6-Mäuse wurden zufällig in sieben Gruppen eingeteilt ( n   = 6 pro Gruppe), einschließlich N, N+F21 KO, H, H+F21, H+F21 KO, H+AAV-H19 und H+F21 KO +AAV-H19. FGF21 wurde von Prospec (CYT-281, Prospec, Rehovot, Israel) erhalten. Kurz gesagt wurde FGF21 (1 mg) in 10 ml 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA)-Lösung gelöst. Dann wurde das Medikament Mäusen in der vorgeschriebenen Dosis von 200 μg/kg/Tag intraperitoneal injiziert, bevor es in die Hypoxiekammer gelangte. Das AAV-Virus wurde konstruiert und der Maus durch die Schwanzvene in einer Dosis von 1 × 10 11 injiziertvirales Genom (vg)/Maus am ersten Tag und wiederholt am 14. Tag. Alle Hypoxie-Gruppen wurden 4 Wochen lang alle Tage in einer normobaren hypoxischen Kammer (9 %–11 % Sauerstoffkonzentration) untergebracht, und alle Normoxie-Gruppen wurden Raumluft ausgesetzt. Allen Mäusen wurde freier Zugang zu Futter und Wasser gewährt.2.2 Invasive hämodynamische und RV-HypertrophiemessungenInvasive hämodynamische Messungen wurden wie beschrieben gemessen.  9  Zur Bestimmung des mittleren rechtsventrikulären Drucks (mRVP) und des mittleren Karotisarteriendrucks (mCAP) wurden ein Bio Amp und ein PowerLab 8/35 Mehrkanal-Biosignalaufzeichnungssystem (AD Instruments, AUS) verwendet. Um die RV-Hypertrophie zu beurteilen, wurde der rechte Ventrikel vom linken Ventrikel und vom interventrikulären Septum seziert, und dann wurden diese sezierten Proben gewogen, um das Verhältnis des Gewichts des rechten Ventrikels zum Gewicht des linken Ventrikels plus interventrikuläres Septum (RV/LV+S) wie zu erhalten sowie das Verhältnis von rechtem Ventrikelgewicht zu Körpergewicht (RV/BW).2.3 Gewebefärbung10 μm dicke, in Paraffin eingebettete Lungengewebeblöcke wurden wie zuvor beschrieben geschnitten.  9 Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung wurde gemäß den Routineprotokollen durchgeführt. Die Pulmonalarterien wurden zufällig ausgewählt (Außendurchmesser von 25–100 mm) mit einem inversen Nikon-Mikroskop (Nikon, Tokio, Japan). Wir haben die Verhältnisse der Pulmonalarterienwandfläche zur Gesamtfläche (WA/TA) und die Verhältnisse der Wanddicke zur Gesamtdicke (WT/TT) berechnet, um den Umbau der Pulmonalarterie durch Image-Pro Plus 6.0 (Media Kybernetik, USA). Die Masson-Färbung wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt (Masson's Trichrome Stain Kit, Solarbio, Beijing, China). Das Verhältnis der Kollagenfläche zur Gesamtfläche der Aufzeichnungsfläche wurde berechnet, um den Grad der Kollagenablagerung widerzuspiegeln. Sechs Mäuse wurden ausgewählt und auf WA/TA, WT/TT und Kollagenablagerung bewertet.2.4 Zyto-Immunfluoreszenz-NachweisFür die Immunfluoreszenzfärbung wurden rPASMCs, die auf Glasdeckgläsern ausgesät wurden, mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) für 30 min bei RT fixiert. Die Zellen wurden permeabilisiert und in 0,1 % Triton X-100 und 5 % BSA für 60 min bei RT blockiert. Anschließend wurden die Zellen über Nacht bei 4°C mit Ki67- (1:500, AF0198, Affinity) und MYH11- (1:200, ab53219, Abcam) Antikörpern leicht inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Zellen mit einer Mischung aus Alexa Fluor 488 Esel-Anti-Kaninchen (A21206) und Alexa Fluor 546 Esel-Anti-Maus (A10036) (alle 1:1000, Invitrogen)-Antikörpern in einer Dunkelkammer für 60 min bei inkubiert RT. Die Zellen wurden dann in DAPI (1:1000, Sigma) für 5 min inkubiert. Die Bilder wurden unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops (Olympus, Tokio, Japan) aufgenommen. Das Verhältnis von Ki67 + -Zellen zu den gesamten rPASMCs des Aufzeichnungsbereichs wurde berechnet und analysiert.2.5 RNA-Isolierung und qRT-PCRGesamt-RNA wurde aus dem Lungengewebe und rPASMCs unter Verwendung von Trizol (Invitrogen) und Chloroform extrahiert. Relative cDNA wurde aus 1 mg RNA unter Verwendung des iScript-cDNA-Synthesekits (Bio-Rad, USA) synthetisiert. Die lncRNAs und Genexpression wurden mittels qRT-PCR (CFX96 Real-Time System, Bio-Rad, USA) gemessen. β-Aktin oder GAPDH dienten als endogene Kontrollen. Der relative fold change wurde mit der 2 –△△CT Methode berechnet. Die Primersequenzen sind in Tabelle   1  gezeigt .TABELLE 1. In dieser Studie für qRT-PCR verwendete PrimerGen/SeriennummerPrimer-SequenzNR_130974.1 (H19)F:5′-GCTCCACTGACCTTCTAAACGA−3′R: 5′-GACGATGTCTCCTTTGCTAACTATC−3′XR_001781760.1F: 5′-CCTTGCGACAGTGGTAGAATCAC−3′R: 5′-TATAAGGCAGAGCGTGAGGGAC−3′ENSMUST00000126427F: 5′-ATCCTCCTCCTTCCTAGTCATGG−3′R: 5′-GGAGACAGGGCAGGACTTTTAG−3′ENSMUST00000195990F: 5′-GCTGAGGATATAGCCAAGTGGAGA−3′R: 5′-TGGAACGGGACTGTTAGCTAGG−3′ENSMUST00000148335F: 5′-CCCACTCTGTGATCTCCTACGA−3′R: 5′-TGCGGGACTTTGGTGTCTTC−3′NR_040442.1F: 5′-AGAAAACACAACGACACAGCCC−3′R: 5′-AGCTCTACTCGCATTCTTCACGT−3′ENSMUST00000212043F: 5′-GCCACCATTAAGCAGCGACA−3′R: 5′-GGTAAGCTGCCGCAGAGTTC−3′ENSMUST00000190311F: 5′-CCTCCTTCTAGACGAGGCTTCTT−3′R: 5′-TGTCTGTAAAGGTTGTGAACTCCAC−3′NR_040630.1F: 5′-CAATGTGCAGTTGCTGTGAGAG−3′R: 5′-CTTCTGCAAGTTGCCTGTGTTT−3′ENSMUST00000218666.1F: 5′-CCCTCCCGAGGTTCTCCATT−3′R: 5′-TAATGCACAGAGACCCGCC−3′β-AktinF: 5′-TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG−3′R: 5′-ACATCTGCTGGAAGGTGGACA−3′ 2.6 Western-Blot-ErkennungZellen oder isolierte Lungen- und Lebergewebe wurden mit RIPA-Puffer (Promega, Madison, WI, USA) auf Eis lysiert. Unter Verwendung eines FastPrep-24 5G-Instruments (MP Biomedicals, CA, USA) wurden Lungengewebe homogenisiert und dann die Überstände gesammelt. Die Proteinkonzentrationen wurden mit einem Pierce BCA-Proteintestkit (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA) gemessen. Trennen Sie Proben mit 20–40 µg Protein durch 5–12 % SDS-PAGE und übertragen Sie sie auf PVDF (0,2 und 0,45 μm, Millipore, Billerica, MA, USA). Die Membranen wurden in 5% fettfreier Trockenmilch für 1,5 h blockiert und über Nacht bei 4°C auf dem Schüttler mit primären Antikörpern inkubiert. Nach Inkubation mit sekundären Antikörpern. Die Proteine ​​wurden mit ECL-Reagenz (Pierce, WI, USA) für den Blot-Nachweis behandelt. Die verwendeten Primärantikörper waren wie folgt: Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG H&L (1:10000, ab205718, Abcam), Kaninchen-Anti-FGF21 (1:1000, ab171941, Abcam), Kaninchen-Anti-TSC1 (1:1000, ab270967, Abcam), Kaninchen-Anti-Phospho-S6K (Thr389, 1:1000, #9234, Abcam), Kaninchen-Anti- S6K (1:1000, ab32529, Abcam), Kaninchen-Anti-Phospho-mTOR (Ser2448, 1:1000, ab109268, Abcam), Kaninchen-Anti-mTOR (1:1000, ab2732, Abcam), Kaninchen-Anti-Phospho-EIF4EBP1 ( Thr37/46, 1:1000, Nr. 2855, CST), Kaninchen-anti-EIF4EBP1 (1:1000, Nr. 9644, CST) und Kaninchen-anti-β-ACTIN (1:1000, Nr. 4970, CST). Die Experimente wurden mindestens dreimal wiederholt und β-ACTIN wurde als interne Kontrolle verwendet. Das Gelbild wurde mit Image Lab 6.0 analysiert. Die „angepassten Gesamtbandenvolumina“ wurden dann auf die Dichten des Housekeeping-Gens, β-ACTIN, derselben Bahn normalisiert und geblottet, um eine relative Expression zu erhalten. #9234, Abcam), Kaninchen-Anti-S6K (1:1000, ab32529, Abcam), Kaninchen-Anti-Phospho-mTOR (Ser2448, 1:1000, ab109268, Abcam), Kaninchen-Anti-mTOR (1:1000, ab2732, Abcam ), Kaninchen-Anti-Phospho-EIF4EBP1 (Thr37/46, 1:1000, Nr. 2855, CST), Kaninchen-Anti-EIF4EBP1 (1:1000, Nr. 9644, CST) und Kaninchen-Anti-β-ACTIN (1:1000, Nr. 4970, CST). Die Experimente wurden mindestens dreimal wiederholt und β-ACTIN wurde als interne Kontrolle verwendet. Das Gelbild wurde mit Image Lab 6.0 analysiert. Die „angepassten Gesamtbandenvolumina“ wurden dann auf die Dichten des Housekeeping-Gens, β-ACTIN, derselben Bahn normalisiert und geblottet, um eine relative Expression zu erhalten. #9234, Abcam), Kaninchen-Anti-S6K (1:1000, ab32529, Abcam), Kaninchen-Anti-Phospho-mTOR (Ser2448, 1:1000, ab109268, Abcam), Kaninchen-Anti-mTOR (1:1000, ab2732, Abcam ), Kaninchen-Anti-Phospho-EIF4EBP1 (Thr37/46, 1:1000, Nr. 2855, CST), Kaninchen-Anti-EIF4EBP1 (1:1000, Nr. 9644, CST) und Kaninchen-Anti-β-ACTIN (1:1000, Nr. 4970, CST). Die Experimente wurden mindestens dreimal wiederholt und β-ACTIN wurde als interne Kontrolle verwendet. Das Gelbild wurde mit Image Lab 6.0 analysiert. Die „angepassten Gesamtbandenvolumina“ wurden dann auf die Dichten des Housekeeping-Gens, β-ACTIN, derselben Bahn normalisiert und geblottet, um eine relative Expression zu erhalten. CST) und Kaninchen-anti-β-ACTIN (1:1000, #4970, CST). Die Experimente wurden mindestens dreimal wiederholt und β-ACTIN wurde als interne Kontrolle verwendet. Das Gelbild wurde mit Image Lab 6.0 analysiert. Die „angepassten Gesamtbandenvolumina“ wurden dann auf die Dichten des Housekeeping-Gens, β-ACTIN, derselben Bahn normalisiert und geblottet, um eine relative Expression zu erhalten. CST) und Kaninchen-anti-β-ACTIN (1:1000, #4970, CST). Die Experimente wurden mindestens dreimal wiederholt und β-ACTIN wurde als interne Kontrolle verwendet. Das Gelbild wurde mit Image Lab 6.0 analysiert. Die „angepassten Gesamtbandenvolumina“ wurden dann auf die Dichten des Housekeeping-Gens, β-ACTIN, derselben Bahn normalisiert und geblottet, um eine relative Expression zu erhalten.2.7 Zellkultur und TransfektionZellisolierung, Kulturen und Hypoxie-Expositionsverfahren waren wie zuvor beschrieben.  21  Bei Erreichen von 80–90 % Konfluenz wurden rPASMCs passagiert und anschließend für Experimente in den Passagen 4–6 verwendet. RPASMCs waren zum Zeitpunkt der Behandlung zu 60–70 % konfluent. Die siRNAs und Plasmide wurden von RiboBio Co. Ltd. (Guangzhou, China) synthetisiert. Die Transfektion von siRNAs und Plasmiden wurde mit 70–80 % konfluenten Zellen unter Verwendung des Transfektionsreagens Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific Inc.) durchgeführt. Die Effizienz des lncRNA-Knockdowns und der Überexpression wurde nach 24-stündiger Hypoxie-Exposition bewertet. Darüber hinaus wurde die effizienteste durch qRT-PCR ausgewählt. Die verwendeten Sequenzen für siRNA und Plasmid sind in Tabelle  S1  gezeigt .2.8 ZellproliferationsassayEin Zellzählkit-8 (CCK--Assay (Dojindo, Kumamoto, Japan) wurde wie zuvor beschrieben verwendet.  19  Kurz gesagt, die rPASMCs wurden unterschiedlichen Behandlungen mit oder ohne siRNA oder Plasmid unterzogen und dann gezählt, in Kulturplatten mit 96 Vertiefungen mit einer Dichte von 8–10 × 10 3 Zellen/Vertiefung ausgesät und 24 h unter kultiviert Hypoxie. Die rPASMCs wurden anschließend mit 10 μl CCK-8-Lösung für 2–4 h behandelt. Die Extinktion der Platte wurde unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts Bio-Rad Xmark-Spektrophotometer (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) bei einer dualen Wellenlänge von 450/550 nm gemessen.2.9 RNA-Sequenzierung und bioinformatische AnalyseRNA-Isolierung und -Sequenzierung wurden von RiboBio Co. Ltd. durchgeführt. Kurz gesagt, RNA wurde gemäß Routineprotokollen extrahiert und gereinigt und auf Qualität und Integrität überprüft. Das Epicenter Ribo-Zero rRNA Removal Kit (Illumina, San Diego, Kalifornien, USA) wurde verwendet, um rRNA aus der Gesamt-RNA zu entfernen und sie auf etwa 200 bp zu fragmentieren. Anschließend wurde die gereinigte RNA unter Verwendung des NEBNext ® Ultra™ RNA Library Prep Kit for Illumina (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers einer Erststrang- und Zweitstrang-cDNA-Synthese unterzogen Adapterligation und Low-Cycle-PCR wurden zur Anreicherung verwendet. Die gereinigten Produkte der I-Bibliothek wurden mit der Tapestation 2200 (Agilent) und Qubit ® bewertet2.0 (Life Technologies/Thermo Fisher Scientific Inc.). Anschließend wurden alle Bibliotheken auf 10 pM für die Cluster-Generierung in situ auf einer HiSeq 3000-Paired-End-Fließzelle verdünnt. Nach dem Entfernen von Reads mit Adaptersequenzen unter Verwendung von ploy-N bei niedriger Qualität aus den Rohdaten wurden die sauberen Reads erhalten. HISAT2 wurde verwendet, um die sauberen Lesevorgänge auf das Maus-Referenzgenom (mm10) mit Standardparametern auszurichten. Dann wurde für jedes Genmodell HTSeq verwendet, um ausgerichtete kurze Lesevorgänge in Lesezählungen umzuwandeln.Das R-Paket „limma“ wurde verwendet, um die differentiell exprimierten lncRNAs zu identifizieren. Die Heatmap wurde mit dem R-Paket „heatmap.2“ generiert. Das Venn-Diagramm wurde verwendet, um überlappende und nicht überlappende lncRNAs zu identifizieren. Die phylogenetische Analyse wurde unter Verwendung der Software BEAST v1.8.0 (  www.beast2.org  ) durchgeführt. Die subzelluläre H19-Lokalisierung wurde unter Verwendung der lncLocator (  www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/lncLocator/)-Datenbanken  vorhergesagt . Zur Bestimmung der signifikant angereicherten Gensets wurde die Software Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) (Version 4.0.1) eingesetzt. In unserer Studie wurden die Hallmark-Gensets verwendet, um den normalisierten Anreicherungswert (NES) zu berechnen. Dann wurde das 'ggplot2'-Paket verwendet, um die koregulierten Pfade aufzuzeichnen.2.10 Doppel-Luciferase-Reportergen-AssayDie 293T-Zelllinie (ATCC, Manassas, VA, USA) wurde verwendet, um einen Luciferase-Reporter-Assay durchzuführen. Das Glühwürmchen-Luciferase codierende Gen stand unter der Kontrolle des CMV-Promotors und des H19-Promotors (RiboBio Co. Ltd.). Transduzierte Zellgruppen (pGL3-Basic, pGL3-Basic-rH19-Promotor und pGL3-Basic-EIF4EBP1-Reporter) wurden in Platten mit 96 Vertiefungen (2 × 10 4 /Vertiefung) kultiviert und dann mit pcDNA3·1 und pcDNA-H19 transduziert Plasmide (RiboBio Co. Ltd.) unter Verwendung von Lipofectamine 3000. Die Luciferase-Aktivität wurde unter Verwendung eines Dual-Luciferase-Reporter-Assay-Systems (Promega Corporation, Madison, WI, USA) auf einem Mikroplatten-Luminometer (Promega Corporation) gemäß den Protokollen des Herstellers gemessen. Experimente für jede Bedingung wurden dreifach durchgeführt.2.11 Konstruktion von H19-Überexpressions-Adeno-assoziierten VirusvektorenRekombinante Adeno-assoziierte Virusvektoren des Serotyps 9 (rAAV9), die Maus-H19 exprimieren, wurden von Taitool Bioscience Co., Ltd (Shanghai, China) hergestellt. Maus-H19-DNA wurde durch Polymerase-Kettenreaktion aus komplementärer Maus-Splenozyten-DNA unter Verwendung der Primer 5'-ACCGGGTGTGGGAGGGGGGTG-3' und 5'-ATGACTGTAACTGTATTTATTGATGGACCCA-30 amplifiziert, und dann wurde das DNA-Segment in das pAAV-CMV_bGI-PA-Plasmid inseriert pAAV-CMV_bGI-mH19 PA-Vektor konstruieren. Der AAV-Vektor wurde gemäß dem zuvor beschriebenen Protokoll zur Transfektion mit drei Plasmiden und keinem Adenovirus mit geringfügigen Änderungen zur Verwendung des aktiven Deflationssystems hergestellt.  22 Kurz gesagt, 60 % fusionierte humane embryonale Nieren-293-Zellen wurden in einem großen Kulturgefäß mit aktiver Luftzirkulation kultiviert, und das transgene Provirus-Plasmid, das chimäre AAV-1-Helferplasmid (p1RepCap) und das Adenovirus-Helferplasmid pAdeno (Avigen Inc) wurden gemeinsam transfiziert . Das rohe Viruslysat wurde durch zwei Runden Cäsiumchlorid-Zentrifugation in zwei Schichten gereinigt. Der Titer des ursprünglichen Virus relativ zum Plasmidstandard wurde durch Dot-Blot-Hybridisierung bestimmt, und dann wurde die Stammlösung zuvor in HN-Puffer (50 mmol/L HEPES, pH 7,4, 0,15 mol/L NaCl) gelöst Injektion. Vor dem Betreten der geschlossenen Hypoxiekammer am 1. Tag injizierten wir der Maus das oben erwähnte AAV-Virus in einer Dosis von 1 × 10 11 durch die Schwanzvenevirales Genom (vg)/Maus und wiederholte die Injektion am 14. Tag. Am 28. Tag wurden hämodynamische Daten erhoben.2.12 Statistische AnalyseAlle statistischen Analysen wurden mit GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) durchgeführt. Alle Daten wurden als Mittelwert ± Standardfehlermittelwert (SEM) ausgedrückt. Alle präsentierten Ergebnisse wurden aus mindestens drei unabhängigen Experimenten dargestellt. Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurden durch den ungepaarten zweiseitigen Student's t - Test analysiert, und Mehrfachvergleiche wurden durch ANOVA, gefolgt von einem Post-Hoc-Test von Bonferroni, analysiert. P -Werte von < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.3 ERGEBNIS3.1 FGF21 lindert HPH in vivoAngesichts der Tatsache, dass FGF21 vorteilhafte Wirkungen bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen zeigt,  23  -  25  untersuchten wir zuerst das Expressionsniveau von FGF21 in HPH-Mäusen. HPH-Mäuse zeigten eine verringerte hepatische FGF21-Expression und Plasma-FGF21-Spiegel, und die exogene Verabreichung von FGF21 erhöht die Leber- und Plasma-FGF21-Spiegel (Abbildung  S1  A-B, Ergänzungsmaterial und Methode). Verglichen mit gesunden Kontrollen (HCs) waren die zirkulierenden FGF21-Spiegel bei Probanden mit Höhen-PH (HAPH) deutlich verringert (Abbildung  S1  C der Hintergrundinformationen). Diese Daten zeigen, dass FGF21 bei HAPH-Patienten herunterreguliert ist und eine Rolle bei der PH-Erkrankung spielt.Als nächstes untersuchen wir die Wirkung von FGF21 auf HPH. Der erhöhte mRVP- und rechtsventrikuläre Hypertrophieindex (wiedergegeben durch RV/(S+LV) und RV/WT) bei Hypoxie-exponierten Mäusen im Vergleich zu Normoxie-exponierten Mäusen zeigt, dass das PH-Modell erfolgreich etabliert wurde. Die Verabreichung von FGF21 verringerte das mRVP bei Mäusen signifikant, während das mCAP nicht betroffen war (   1A –C  ). Wie erwartet reduzierte die Behandlung mit FGF21 auch signifikant die Hypoxie-induzierte rechtsventrikuläre Hypertrophie (Abbildung   1D-E  ). Darüber hinaus wurden die durch Hypoxie induzierte Pulmonalarterienmuskulatur, wie durch die Verhältnisse von WA/TA (%) und WT/TT (%) angezeigt, und übermäßige Kollagenablagerungen um die Pulmonalarterien durch die Auffüllung von FGF21 deutlich blockiert (Abbildung   1F- ich ). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Behandlung mit FGF21 PH weitgehend rückgängig machen kann.

ABBILDUNG 1 Im Abbildungsbetrachter öffnen Power Point PH-Verbesserung bei mit FGF21 behandelten Mäusen. (A) Zusammenfassung repräsentativer Bilder von mRVP-Wellen. (BC) Quantitative Analyse von mRVP ( und mCAP (C) in erwachsenen C57BL/6-Mäusen der N-, H- und H+F21-Gruppe ( n = 6). (DE) Quantitative Analyse von RV/(S+LV) (D) und RV/WT (E) jeder Gruppe ( n = 6). (F) Oberes Feld: HE-Färbung von Lungenarterien in Lungenparaffinschnitten. Unteres Bild: Masson-Färbung von Pulmonalarterien in Lungenparaffinschnitten. (GH) Quantitative Analyse von WA/TA (%) (G) und WT/TT (%) (H) jeder Gruppe ( n = 6), wie in (F) gezeigt. (I) Quantitative Analyse der Rate der Fibrosefläche jeder Gruppe ( n = 6), wie in (F) gezeigt. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM, ANOVA-Bonferroni-Post-hoc-Test, *p < dargestellt0,05 , **p < 0,01 , ***p < 0 . 001 , ****p < 0 . 0001 . Maßstabsbalken, 20 μm3.2 Analyse von lncRNA-Expressionsprofilen in mit FGF21 behandelten Mäusen und Identifizierung von H19 in vivoUm die unterschiedlichen lncRNA-Expressionsprofile in der Normoxie-Expositionsgruppe (N), Hypoxie-Expositionsgruppe (H) und Hypoxie-Exposition plus FGF21-Behandlungsgruppe (H+F21) zu bestimmen, wurde eine RNA-Sequenzierung an Lungengewebeproben dieser Mäuse durchgeführt. Der Arbeitsablauf der bioinformatischen Analyse ist in Abbildung   2A  dargestellt . Insgesamt wurden 171 lncRNAs anhand der Selektionskriterien ( p -Wert <0,05, N & H & H+F21) gescreent, davon waren 95 co-hochreguliert (N < H & H+F21 < H), 71 waren co-herunterreguliert (N > H & H+F21 > H), und die verbleibenden 5 wurden ausgeschlossen (N > H > H+F21 oder N < H < H+F21) (Abbildung   2B  ). Alle regulierten lncRNAs und die Top 10 co-regulierten lncRNAs, die mit zwei Methoden gescreent wurden (N < H & H+F21 < H, oder N > H & H+F21 > H, |Wechsel falten| >1·5, pWert <0,05) sind in der Heatmap dargestellt (Abbildung   2C  , Abbildung  S2 und  Tabelle   2  ). Die Expressionsänderungen der Top10 co-herunterregulierten lncRNAs (N > H & H+F21 > H) wurden durch qRT-PCR in den getesteten Lungengewebeproben validiert (Abbildung   2D  ). Unter ihnen wurde H19 (NR_130974.1) in der H+F21-Gruppe reichlich exprimiert (Tabelle   2  ). Die phylogenetische Analyse ergab, dass H19 bei Menschen, Mäusen und Ratten hoch konserviert ist (Abbildung   2E  ) und laut lncLocator hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert ist (Abbildung   2F  ). Darüber hinaus wurde berichtet, dass H19 eine multifunktionale lncRNA ist, die das Zellwachstum reguliert.  20  ,  26 Daher nehmen wir an, dass H19 eine wichtige regulatorische Rolle bei HPH spielen könnte.

FIGUR 2 Im Abbildungsbetrachter öffnen Power Point FGF21 fördert die H19-Transkription unter Hypoxie-Exposition in vivo . (A) Das Fluss-Prozess-Diagramm der RNA-Sequenzierungsdatenanalyse. ( Venn-Diagramm zeigte die Schnittmenge unterschiedlich exprimierter lncRNAs zwischen N vs. H und H vs. H+F21. Unter den 171 koregulierten lncRNAs gab es 95 Ko-Hochregulierung und 71 Ko-Herunterregulierung. (C) Die Heatmap der Top 10 co-upregulierten und Top 10 co-downregulierten lncRNAs in der H-Gruppe im Vergleich zur N-Gruppe bzw. H + F21-Gruppe. Rot steht für Hochregulierung und Blau für Herunterregulierung. Die Zahlen in der Heatmap geben logarithmische Ausdruckswerte in jeder Probe an. (D) Validierung von RNA-Sequenzierungsdaten mit qRT-PCR. Die Top 10 der co-herunterregulierten lncRNA in der H-Gruppe wurde im Balkendiagramm gezeigt ( n= 3). (E) Phylogenetischer Baum von H19, zeigte hochgradige Sequenzkonservierungen von H19. (F) Das Ergebnis der H19-Lokalisierung in lncLocator. Der Maximalwert war 0,846236534468, was anzeigt, dass H19 hauptsächlich im Cytosol lokalisiert war. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM, ANOVA-Bonferroni-Post-hoc-Test, *p < 0,05 , **p < 0,01 , ***p < 0,001 , **** p < 0,0001 dargestelltTABELLE 2. Top10 von FGF21-regulierter lncRNANein.lncRNAAveE.NAveE.HAveE. FFC (N/H)FC (F/H)P (N/H)P (H/F)1.NR_130974.1(H19)173.889.8209.41,932.330,050,042.XR_001781760.1810,873101.2591.250,010,013.ENSMUST00000126427.151.427541,902.000.000,014.ENSMUST00000195990.138.424.249.21.592.030,010.005.ENSMUST00000148335.143.41740.82.552.400,010.006.NR_040442.121.411.6261,852.240,010,087.ENSMUST00000212043.119.810.6221,872.080,050,018.ENSMUST00000190311.122.21.821.412.3311.890,020,019.NR_040630.111.23.811.42,953.000.000,0510.ENSMUST00000218666.19.64.810.62.002.210,050,031.ENSMUST00000190228.128.454.621.60,520,400,030,012.ENSMUST00000210130.17.216.46.80,440,420,050,053.XR_001784065.17.219.48.80,370,450,030,024.ENSMUST00000209301.18.825.611.80,340,460,010.005.NR_102381.14.213.82.60,300,190,030,046.ENSMUST00000143671.11.4510,280,200,040,017.ENSMUST00000210360.11.671.60,230,230,050,058.XR_386252.21.25.81.40,210,240,050,049.XR_868040.21.27.21.80,170,250,050,0510.ENSMUST00000147177.10,65.60,40,110,070.000.00 3.3 FGF21 reduziert teilweise die Hypoxie-induzierte rPASMC-Proliferation durch H19 in vitroUm die funktionelle Rolle von H19 bei HPH weiter zu untersuchen, untersuchten wir zusätzlich die H19-Expression in rPASMCs. Die Ergebnisse der qRT-PCR-Analyse zeigten, dass H19 durch FGF21 dosisabhängig im Bereich von 12,5 bis 100 ng/ml nach 24-stündiger Exposition gegenüber Hypoxie hochreguliert wurde (Abbildung   3A  ), was darauf hindeutet, dass H19 die therapeutische Wirkung von vermitteln könnte FGF21. Anschließend wurden Gain- und Loss-of-Function-Studien durchgeführt. Die Effizienz von H19-Knockdown oder H19-Überexpression wurde durch qRT-PCR verifiziert (Abbildung   3B,F  ). Die Lebensfähigkeit der Zellen und die Proliferationsraten waren in den Hypoxiegruppen höher als in den Kontrollen, aber dieses Phänomen wurde durch die Überexpression von H19 gemildert (   3C  ). Darüber hinaus regulierte die Überexpression von H19 die Hypoxie-induzierte Expression von Ki67 in MHY11 herunter+ rPASMCs (MHY11 ist ein Marker des PASMC-Phänotyps) (Abbildung   3D-E  ). Im Gegensatz dazu erhöhte der Knock-down von H19 die Lebensfähigkeit der Zellen und die Proliferationsraten (Abbildung   3G  ) und den Ki67-Spiegel (Abbildung   3H-I  ) signifikant. Diese Phänomene wurden teilweise rückgängig gemacht, indem Zellen mit FGF21 behandelt wurden (Fig  .  3G-I  ). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass FGF21 die Hypoxie-induzierte rPASMC-Proliferation durch H19 in vitro teilweise reduziert.

FIGUR 3 Im Abbildungsbetrachter öffnen Power Point FGF21 reduziert teilweise die Hypoxie-induzierte rPASMC-Proliferation durch H19 in vitro . (A) qRT-PCR-Analyse der H19-Expression in kultivierten rPASMCs unter FGF21-Behandlung (0, 12,5, 25, 50, 100 ng/ml) nach Hypoxie-Exposition für 24 h ( n = 3, verglichen mit H-Gruppe). ( Untersuchung der überexprimierten Effizienz des H19-Plasmids unter Hypoxiebedingungen durch qRT-PCR ( n = 3, verglichen mit leerer Vektorkontrolle, ANOVA-Bonferroni-Post-Hoc-Test). (C) CCK-8-Assay detektierte die Zelllebensfähigkeit in rPASMCs, die mit leerer Vektor-pcDNA oder H19-Plasmid (1 μg) nach 24-stündiger Hypoxie-Exposition transfiziert wurden ( n= 3). (D) Doppelte Immunfärbung von Ki67 (grün) und MYH11 (rot) in rPASMCs, die mit Kontrollen und H19-Plasmid (H) nach 24-stündiger Hypoxie-Exposition transfiziert wurden. (E) Quantitative Analyse des Prozentsatzes von Ki67 + MHY11 + zu MHY11 + -Zellen, wie in (D) gezeigt ( n = 20, Daten zeigen kumulative Ergebnisse aus 4 unabhängigen Experimenten). (F) Untersuchung der Knockdown-Effizienz von H19-siRNA unter Hypoxiebedingungen durch qRT-PCR ( n = 3, verglichen mit leerer Vektorkontrolle, ANOVA-Bonferroni Post-Hoc-Test). (G) CCK-8-Assay detektierte die Zelllebensfähigkeit in rPASMCs, die mit siRNA-Kontrolle oder H19-siRNA (20 nmol/l) oder FGF21 (100 ng/ml) nach Hypoxie-Exposition für 24 h ( n= 3). (H) Doppelte Immunfärbung von Ki67 (grün) und MYH11 (rot) in rPASMCs, die mit Kontrollen oder siRNA oder FGF21 nach 24-stündiger Hypoxie-Exposition transfiziert wurden. (I) Quantitative Analyse des Prozentsatzes von Ki67 + MHY11 + zu MHY11 + -Zellen, wie in (H) gezeigt ( n = 20, Daten zeigen kumulative Ergebnisse von 4 unabhängigen Experimenten). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM, ANOVA-Bonferroni-Post-Hoc-Test, *p < 0,05 , **p < 0,01 , ***p < 0,001 , **** p < 0,0001 dargestellt . Maßstabsbalken, 20 μm3.4 Hypoxie-induzierte PH-Steigerung bei FGF21-KO-MäusenIn dieser Studie wurden Fgf21-  KO-Mäuse mit einem C57BL/6-Hintergrund verwendet, um die Rolle von FGF21 bei der Pathogenese von PH zu bestimmen (Abbildung  S3  ). MRVP war bei Fgf21-  KO-Mäusen im Vergleich zu Kontrollen aus demselben Wurf unter Hypoxie-Bedingungen weiter erhöht, wohingegen dieser Effekt unter Normoxie   -Bedingungen nicht beobachtet wurde ( 4A –B  ). Es gab keinen offensichtlichen Unterschied im mCAP von Fgf21-  KO-Mäusen im Vergleich zu dem der Kontrollen aus dem gleichen Wurf, mit oder ohne Exposition gegenüber Hypoxie (   4C  ). Jedoch RV/(S+LV) und RV/WT in Fgf21 Es wurde festgestellt, dass KO-Mäuse, die Hypoxie ausgesetzt waren, deutlich höher waren als diejenigen in den Kontrollen von Wurfgeschwistern. Diese Wirkungen waren unter Hypoxiebedingungen besonders ausgeprägt, aber einige geringfügige Änderungen wurden auch unter Normoxiebedingungen beobachtet (Abbildung   4D-E  ). Die H&E-Färbung wurde verwendet, um den Umbau der Pulmonalarterien zu bewerten. Die Verhältnisse von WA/TA und WT/TT in Fgf21  KO-Mäusen, die Hypoxie ausgesetzt waren, waren im Vergleich zu Kontrollen aus dem gleichen Wurf signifikant erhöht (   4F  –H ). Darüber hinaus zeigte die Trichrom-Färbung nach Masson (   4F , 4I  ), dass die übermäßige Ablagerung von Kollagen um die Lungenarterien mit der Exposition gegenüber Hypoxie verbunden ist. Zusammen zeigten diese Ergebnisse, dass der Verlust von FGF21 PH deutlich verschlimmert.

FIGUR 4 Im Abbildungsbetrachter öffnen Power Point PH-Verstärkung in FGF21 KO-Mäusen. (A) Zusammenfassung repräsentativer Bilder von mRVP-Wellen. (BC) Quantitative Analyse von mRVP ( und mCAP (C) in erwachsenen FGF21-Knockout-Mäusen (F21 KO) und ihren Wurfgeschwistern (WT) unter Normoxie- oder Hypoxie-Bedingungen ( n = 6). (DE) Quantitative Analyse von RV/(S+LV) (D) und RV/WT (E) jeder Gruppe ( n = 6). (F) Linkes Feld: HE-Färbung von Lungenarterien in Lungenparaffinschnitten. Rechtes Feld: Masson-Färbung von Pulmonalarterien in Lungenparaffinschnitten. (GH) Quantitative Analyse von WA/TA (%) (G) und WT/TT (%) (H) jeder Gruppe ( n = 6), wie in (F) gezeigt. (I) Quantitative Analyse der Rate der Fibrosefläche jeder Gruppe ( n= 6), wie in (F) gezeigt. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM, ANOVA-Bonferroni-Post-Hoc-Test, *p < 0,05 , **p < 0,01 , ***p < 0 , dargestellt . 001 , ****p < 0 . 0001 . Maßstabsbalken, 20 μm3.5 H19-Überexpression kehrt den malignen Phänotyp von PH in Wildtyp (WT)- und FGF21 KO-Mäusen umAls nächstes untersuchten wir, ob eine AAV-vermittelte H19 (AAV-H19)-Überexpression eine durch Hypoxie induzierte PH in WT-Mäusen und FGF21-KO-Mäusen umkehren könnte. Wie erwartet kehrte die Verabreichung von AAV-H19 durch intravenöse Schwanzinjektion die Hypoxie-induzierte Lungendruckerhöhung (wiedergegeben durch mRVP) bei WT-Mäusen und FGF21-KO-Mäusen signifikant um, während das mCAP nicht beeinflusst wurde (   5A –C  ). Wie erwartet wurden die Anstiege von RV/(S+LV) und RV/WT unter hypoxischen Bedingungen durch die Behandlung mit AAV-H19 bei WT-Mäusen und FGF21   -KO-Mäusen deutlich reduziert ( 5D –E  ). Darüber hinaus schwächte die AAV-H19-Überexpression auch die Hypoxie-induzierte Pulmonalarterienmuskulatur (Abbildung   5F-H  ) und die übermäßige extravaskuläre Kollagenablagerung (Abbildung   5F, 5I ) in WT-Mäusen und Fgf21-  KO-Mäusen. Daher legen diese Ergebnisse nahe, dass eine Überexpression von AAV-H19 den malignen Phänotyp von HPH in WT-Mäusen und Fgf21-  KO-Mäusen umkehren kann.

ABBILDUNG 5 Im Abbildungsbetrachter öffnen Power Point Die Überexpression von H19 kehrt den malignen Phänotyp von PH in WT- und FGF21-KO-Mäusen um. (A) Zusammenfassung repräsentativer Bilder von mRVP-Wellen. (BC) Quantitative Analyse von mRVP ( und mCAP (C) in erwachsenen Mäusen der N-, H-, H+AAV-H19-, H+F21-KO- und H+F21-KO+AAV-H19-Gruppe ( n = 5–6 ). (DE) Quantitative Analyse von RV/(S+LV) (D) und RV/WT (E) jeder Gruppe ( n = 5–6). (F) Oberes Feld: HE-Färbung von Lungenarterien in Lungenparaffinschnitten. Unteres Bild: Masson-Färbung von Pulmonalarterien in Lungenparaffinschnitten. (GH) Quantitative Analyse von WA/TA (%) (G) und WT/TT (%) (H) jeder Gruppe ( n= 6), wie im oberen Feld in (F) gezeigt. (I) Quantitative Analyse der Rate der Fibrosefläche jeder Gruppe (n = 6), wie im unteren Feld in (F) gezeigt. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM, ANOVA-Bonferroni-Post-hoc-Test, *p < 0,05 , **p < 0,01 , ****p < 0,0001 dargestellt . Maßstabsbalken, 20 μm3.6 FGF21 hemmt den mTORC1/EIF4EBP1-Signalweg unter Hypoxie-Exposition in vivoDie zugrunde liegenden molekularen Mechanismen, die für die Wirkungen von FGF21/H19 verantwortlich sind, wurden weiter untersucht, indem die nachgeschalteten molekularen Ereignisse untersucht wurden. Als nächstes führten wir die Analyse der charakteristischen Gensätze durch GSEA in der Hypoxie + FGF21-Gruppe im Vergleich zum reinen Hypoxie-Pendant durch. Der mTORC1-Weg wurde erweitert und weiter betrachtet, da mTORC1 eine breite Palette zellulärer Prozesse reguliert, einschließlich Proteinsynthese, Zellwachstum, Überleben, Proliferation und Stoffwechsel  27  -  29  (Abbildung   6A  ). In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der GSEA waren sowohl die Gesamtproteinspiegel als auch die Phosphorylierungsspiegel von mTOR, die indirekt die Spiegel von mTORC1 widerspiegeln, bei HPH-Mäusen nach der Behandlung mit FGF21 verringert (Abbildung   6B ). Der Tuberöse-Sklerose-Komplex (TSC1/2) wurde als wichtigster vorgeschalteter inhibitorischer Regulator von mTOR etabliert.  30  ,  31  Als nächstes untersuchten wir die Expression von TSC1 und stellten fest, dass FGF21 das Proteinexpressionsniveau von TSC1 förderte (   6C  ). Aktiviertes mTORC1 phosphoryliert direkt eines seiner nachgeschalteten Hauptsubstrate, nämlich das eukaryotische Translationsinitiationsfaktor-4E-Bindungsprotein 1 (EIF4EBP1) und die ribosomale S6-Kinase (S6K), die eine bedeutende Rolle bei der physiologischen Kontrolle der Translationsinitiation spielen.  32  Im HPH-Mausmodell hemmte FGF21 auch die Expression von EIF4EBP1, Phospho-EIF4EBP1, S6K und Phospho-S6K (Abbildung   6D-E ). Wir haben ferner die Interferenz von FGF21 auf den mTORC1/EIF4EBP1-Signalweg unter Verwendung von FGF21 -  KO-Mäusen verifiziert. Wie erwartet aktivierte der FGF21-  Knockout den Proteinspiegel und den Phosphorylierungsspiegel von mTORC1, EIF4EBP1 und S6K, während er den Proteinexpressionsspiegel von TSC1 verringerte (   6F  –I ).

ABBILDUNG 6 Im Abbildungsbetrachter öffnen Power Point FGF21 inhibiert die mTORC1/EIF4EBP1-Achse in vivo . (A) GSEA-Diagramm des mTORC1-Gensatzes. Das NES war 1,239, was darauf hinwies, dass der mTORC1-Signalweg in der H-Gruppe hochreguliert war. ( Oberes Feld: Western-Blotting detektierte p-mTOR- und mTORC1-Expressionsniveaus in Lungengewebe-Homogenaten der H-Gruppe und der H-plus-F21-Gruppe. Unteres Feld: Quantitative Analyse der p-mTOR- und mTOR-Expressionsniveaus jeder Gruppe ( n = 4). (C) Oberes Feld: Western-Blotting detektierte TCS1-Expressionsniveaus in jeder Gruppe. Unteres Feld: Quantitative Analyse der TCS1-Expressionsniveaus jeder Gruppe ( n = 3). (D) Oberes Feld: Western-Blotting detektierte p-EIF4EBP1- und EIF4EBP1-Expressionsniveaus in jeder Gruppe. Unteres Feld: Quantitative Analyse der p-EIF4EBP1- und EIF4EBP1-Expressionsniveaus jeder Gruppe (n = 4). (E) Oberes Feld: Western Blotting detektierte p-S6K und S6K-Expressionsniveaus in jeder Gruppe. Unteres Feld: Quantitative Analyse der p-S6K- und S6K-Expressionsniveaus jeder Gruppe ( n = 3). (F) Oberes Feld: Western-Blotting detektierte p-mTOR- und mTORC1-Expressionsniveaus in Lungengewebe-Homogenaten der H-Gruppe und der H-plus-F21-KO-Gruppe. Unteres Feld: Quantitative Analyse der p-mTOR- und mTOR-Expressionsniveaus jeder Gruppe ( n = 3). (G) Oberes Feld: Western-Blotting detektierte TCS1-Expressionsniveaus in jeder Gruppe. Unteres Feld: Quantitative Analyse der TCS1-Expressionsniveaus jeder Gruppe ( n= 3). (H) Oberes Feld: Western-Blotting detektierte p-EIF4EBP1- und EIF4EBP1-Expressionsniveaus in jeder Gruppe. Unteres Feld: Quantitative Analyse der p-EIF4EBP1- und EIF4EBP1-Expressionsniveaus jeder Gruppe ( n = 4). (I) Oberes Feld: Western Blotting detektierte p-S6K und S6K-Expressionsniveaus in jeder Gruppe. Unteres Feld: Quantitative Analyse von p-S6K und S6K-Expressionsniveaus jeder Gruppe ( n = 3). Die Daten sind als Mittelwert ± SEM, ungepaarter zweiseitiger Student's t - Test, verglichen mit der H-Gruppe, *p < 0,05 , **p < 0,01 , ***p < 0,001 , **** dargestellt . p < 0,00013.7 FGF21 hemmt die mTORC1/EIF4EBP1-Achse über H19 unter Hypoxie-Exposition in vitroDurch einen Gain-and-Loss-of-Function-Assay fanden wir heraus, dass die phosphorylierten und Gesamt-mTOR-, EIF4EBP1- und S6K-Expressionsspiegel signifikant verringert und die TSC1-Spiegel durch die Überexpression von H19 bei Exposition gegenüber Hypoxie erhöht wurden (Abbildung   7A  ). Der Knockdown von H19 erhöhte die mTOR-, EIF4EBP1- und S6K-Expression und die Phosphorylierungsniveaus und verringerte die TSC1-Expression (   7B  ). Darüber hinaus verstärkte die Überexpression von H19 die Wirkung von FGF21 auf mTOR, EIF4EBP1 und S6K (   7C  ).

ABBILDUNG 7 Im Abbildungsbetrachter öffnen Power Point FGF21 hemmt die mTORC1/EIF4EBP1-Achse über H19 unter Hypoxie-Exposition. (A) Linkes Feld: Western Blotting detektierte das Expressionsniveau von TSC1, p-mTOR, mTOR, p-EIF4EBP1, EIF4EBP1, p-S6K und S6K in rPASMCs, die mit leerer Vektor-pcDNA oder H19-Plasmid (1 μg) nach Hypoxie-Exposition transfiziert wurden für 24 Std. Rechtes Feld: Quantitative Analyse der TSC1-, p-mTOR-, mTOR-, p-EIF4EBP1-, EIF4EBP1-, p-S6K- und S6K-Expressionsniveaus des linken Felds ( n= 3–5, verglichen mit leerer Vektorkontrolle, ANOVA-Bonferroni Post-Hoc-Test). ( Linkes Feld: Western Blotting detektierte das Expressionsniveau von TSC1, p-mTOR, mTOR, p-EIF4EBP1, EIF4EBP1, p-S6K und S6K in rPASMCs, die mit siRNA-Kontrolle oder H19-siRNA (20 nmol/L) nach Hypoxie transfiziert wurden Exposition für 24 h. Rechtes Feld: Quantitative Analyse der TSC1-, p-mTOR-, mTOR-, p-EIF4EBP1-, EIF4EBP1-, p-S6K- und S6K-Expressionsniveaus des linken Felds ( n = 3–6, verglichen mit leerer Vektorkontrolle, ANOVA-Bonferroni Post-hoc-Test ). (C) Linkes Feld: Western-Blotting detektierte das Expressionsniveau von TSC1, mTOR, EIF4EBP1 und S6K in rPASMCs, die mit Kontrollen oder H19-Plasmid oder FGF21 nach 24-stündiger Hypoxie-Exposition transfiziert wurden. Rechtes Feld: Quantitative Analyse der TSC1-, mTOR-, EIF4EBP1- und S6K-Expressionsniveaus des linken Felds ( n= 3–4, verglichen mit leerer Vektorkontrolle, ANOVA-Bonferroni-Post-Hoc-Test). (D) Oberes Feld: Ein schematisches Diagramm der Konstruktionen des Luciferase-Reportergens. Unteres Feld: Quantitative Analyse des Luciferase-Reportergen-Assays. H19-responsiver CMV-Promotor-Luciferase-Reporter wurde in 293T-Zellen mit den angegebenen Plasmiden ( n = 4, ANOVA-Bonferroni Post-hoc-Test) transfiziert. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM, *p < 0,05 , **p < 0,01 , ***p < 0,001 dargestelltEIF4EBP1 bindet an EIF4E und unterdrückt so die Cap-abhängige Proteintranslation am 5'-Cap der mRNA. Darüber hinaus kann mTORC1 EIF4EBP1 phosphorylieren, was zur Trennung von EIF4EBP1 von EIF4E führt, wodurch die Translation von mRNAs im Zusammenhang mit Zellüberleben, Proliferation und Angiogenese gefördert wird.  33  Wu et al. berichteten, dass H19 die Interaktion von EIF4EBP1 und mTORC1 störte und somit die mTORC1-Aktivität in Hypophysentumoren hemmte.  33  Um zu beurteilen, ob H19 eine ähnliche Rolle bei HPH spielt, verwendeten wir einen doppelten Luciferase-Reportergen-Assay. Das Glühwürmchen-Luciferase-Reportergen wurde vom CMV-Promotor (CMV-LUC) angetrieben, um die Wirkung der mRNA-Translation zu bewerten (Abbildung   7D ). Die Transkriptionsaktivität der Luciferase-Reporter, die CMV-LUC enthielten, war deutlich stärker als die von Reportern ohne CMV-LUC, wodurch die Effizienz des LUC-Systems bestätigt wurde (   7D  ). In dieser Studie reduzierte die Co-Transfektion eines Plasmids, das H19 enthielt, signifikant die transkriptionelle Aktivität von CMV-LUC, was darauf hindeutet, dass H19 mit dem EIF4EBP1 interagieren könnte, um die mRNA-Translation zu hemmen (   7D  ).Zusammengenommen zeigten diese Ergebnisse, dass FGF21 die mTORC1/EIF4EBP1-Achse über H19 unter hypoxischen Bedingungen hemmt.4. DISKUSSIONZunehmende Untersuchungen haben über die kardio-zerebrale vaskuläre Schutzwirkung von FGF21 berichtet. Unsere vorläufigen Daten ergaben, dass die exogene Verabreichung von FGF21 HPH in Nagetiermodellen wirksam linderte, was die Lücke von FGF21 in der PH-Forschung teilweise füllt.  8  ,  9  Unsere Forschung zeigte, dass die Verringerung des FGF21-Spiegels im Serum von HAPH-Patienten sowie im Serum und in der Leber von Maus-HPH-Modellen, was darauf hindeutet, dass FGF21 als Schutzfaktor wirken könnte. Wir fanden heraus, dass eine exogene Behandlung mit FGF21 den Hypoxie-induzierten Pulmonalarteriendruck umkehren, den Lungengefäßumbau und die extravaskuläre Kollagenablagerung verschlimmern könnte, während ein FGF21-Mangel diese negativen Auswirkungen bei HPH-Mäusen verschlimmerte (Abbildungen   1  und  4 ). Diese Ergebnisse zeigen, dass FGF21 gegen Gefäßproliferation, entzündliche und hypoxische Schäden wirksam ist, was auf die potenzielle therapeutische Verwendung von FGF21 bei PH hinweist. Schließlich haben frühere Studien herausgefunden, dass FGF21 die Hypoxie-induzierte Herunterregulierung von PPARγ wiederherstellen kann,  8  ,  9  , was einer der proteinregulatorischen Mechanismen sein könnte, durch die FGF21 vor PH schützt. Der Regulationsmechanismus von FGF21 ist jedoch sicherlich ziemlich kompliziert und es muss viel Arbeit geleistet werden, um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen bei mit FGF21 behandelter PH zu verstehen.Es wird allgemein angenommen, dass lncRNA mit menschlicher Gentranskription, -translation, -modifikation und -expression zusammenhängt.  34  Zunehmende Forschungsdaten zeigen, dass lncRNAs mehrere wichtige pathophysiologische Prozesse auf mehreren Ebenen regulieren und in engem Zusammenhang mit vielen wichtigen Krankheiten stehen.  35  Liu et al. untersuchten lncRNA- und mRNA-Expressionsprofile in PH-Ratten, die eine Metforminbehandlung erhielten oder nicht erhielten,  36  und Guo et al. fanden heraus, dass die PDGF-BB-hochregulierte Expression von lncRNA lnRPT die Proliferation von rPASMCs modulieren könnte,  37 was darauf hindeutet, dass erwartet werden kann, dass lncRNAs zu einem Schlüsselregulator eines Proteineingriffs in den Prozess von PH werden. Dementsprechend sammelten wir Lungengewebe von Mäusen aus der N-, H- und H+FGF21-Gruppe und führten eine RNA-Sequenzierung durch. Die erhaltenen RNA-Sequenzierungsdaten zeigten die Veränderungen in der lncRNA-Expression in HPH-Mäusen mit oder ohne FGF21-Behandlung und stellten fest, dass H19 an der mit FGF21 behandelten PH beteiligt ist (   2  ). H19 ist eine hochkonservierte und geprägte lncRNA mit mehreren biologischen Funktionen bei verschiedenen Krankheiten. Die regulatorische Rolle von H19 bei HPH bleibt jedoch unbekannt, und es könnte ein interessantes Ziel sein, das weiter erforscht werden sollte.Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte, dass die H19-Expression bei Herzinsuffizienz von Mäusen und Menschen verringert ist und als vielversprechendes therapeutisches Ziel für die Behandlung von pathologischem Herzumbau fungiert.  38  Diese Befunde einer verringerten H19-Expression stimmen mit unserem Befund einer Abnahme der H19-Expression bei HPH-Mäusen überein. Darüber hinaus spekulieren wir aufgrund der pathologischen Ähnlichkeit zwischen kardialem Umbau und pulmonalem Gefäßumbau, dass H19 ein wirksamer Biomarker und therapeutisches Ziel für die Behandlung von PH ist. Unsere Studie zeigte, dass FGF21 die H19-Expression dosisabhängig förderte und der Knockdown von H19 die Proliferation von rPASMCs signifikant förderte, während die Überexpression von H19 diesen proliferationsfördernden Effekt unter Hypoxie-Exposition umkehrte (Abbildung   3 ). In Übereinstimmung damit haben Fei et al. fanden heraus, dass die Melatonin-hochregulierte Expression von H19 die Proliferation von PAMSCs bei Monocrotalin (MCT)-induzierter PH hemmt,  39  was unsere Feststellung der antiproliferativen Wirkung von H19 bei PH unterstützt. Darüber hinaus haben Li et al.  19  und Maegdefessel et al.  20  berichteten auch über antiproliferative Wirkungen von H19 auf Kardiomyozyten und glatte Muskelzellen der Bauchaorta. Bonnet et al. zeigten, dass H19 in dekompensiertem RV von PAH-Patienten und den MCT-induzierten Ratten mit Pulmonalarterienbandbildung hochreguliert ist.  40 Unterschiedliche Blutproben (Plasma oder Serum), unterschiedliche Modelle, Gewebe- und Zellproben können zu Abweichungen geführt haben. Diese widersprüchlichen Ergebnisse zeigen wahrscheinlich die unterschiedliche Rolle von H19 in physiologischen und pathologischen Prozessen. In biologischen Systemen kann H19 unter bestimmten Bedingungen aktiviert werden, erfüllt aber unter anderen Bedingungen unterschiedliche Funktionen. Zum Beispiel haben mehrere Humanstudien herausgefunden, dass H19 bei hepatozellulärem Karzinom überexprimiert wird.  41  -  43  Zhang  44  und Schultheiss et al.  45 zeigten, dass H19 beim hepatozellulären Karzinom herunterreguliert ist. Diese Diskrepanz kann auf unterschiedliche Stichprobengrößen und Methoden zurückzuführen sein. In dieser Studie verdeutlicht die Verabreichung von AAV-H19 die positive Rolle von H19 bei mit FGF21 in vivo behandelter PH (   5  ).Darüber hinaus zeigte die Signalweg-Anreicherungsanalyse unserer RNA-Sequenzierungsdaten die Beteiligung des mTORC1-Signalwegs an der Vermittlung der Wirkungen von FGF21. MTOR ist eine der Komponenten von mTORC1 und spiegelt indirekt die Werte von mTORC1 wider. Die Aktivierung von mTORC1 induziert die Zellproliferation und das Zellwachstum durch die Förderung der Proteinsynthese, der Ribosomen-Biogenese, der Lipid-Biogenese und des Energiestoffwechsels durch seine nachgeschalteten Ziele EIF4EBP1, p70S6K und sein Substrat S645.  46  -  48  In dieser Studie förderte FGF21 die Expression von H19, das wiederum mTORC1, EIF4EBP1 und S6K hemmt, was darauf hindeutet, dass die Antiproliferationswirkung von FGF21 und H19 auf die Hemmung der mTORC1-Signalübertragung zurückgeführt werden kann (Abbildungen  [url=https://onlinelibrary.wiley.